一种烟草镉转运基因NtHMA4及其克隆方法与应用技术

本发明专利技术公开了烟草镉转运基因NtHMA4及其克隆方法与应用，烟草镉转运基因NtHMA4核苷酸序列如SEQID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQID：No.2所示。本发明专利技术还公开了烟草镉转运基因NtHMA4的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtHMA4基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtHMA4基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。通过调控烟草镉转运基因NtHMA4的表达，可降低镉从烟草根部转运到叶片的转运率，从而降低烟叶的铬含量，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。

【技术实现步骤摘要】
一种烟草镉转运基因NtHMA4及其克隆方法与应用
本专利技术属于遗传工程
，具体涉及一种烟草镉转运基因NtHMA4及其克隆方法与应用。
技术介绍
烟草（Nicotianatabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。烟草属大约有60多种。重金属镉是烟草生长的非必须元素，但容易被吸收，并且通过食物链对人体产生危害。镉随水灌溉和污泥进入土壤中，被土壤吸附的镉一般在0~15cm的表层土壤中积累。土壤中过量的镉，不仅能在烟草体内残留，而且也会对烟草的生长发育起明显的危害作用，破坏叶绿体结构，降低叶绿素含量，叶片发黄，光合过程的减弱，生长缓慢，植株矮小，根系受到抑制，生长受阻，产量下降。镉污染对烟草种子出苗、烟草光合特性、烟草体内矿质元素含量、烟草组织结构、烟草酶活性、烟草生长量和烟叶品质均有较大影响。Cd2+的吸收主要是通过一些对Cd2+具有低亲和性的多底物金属离子转运蛋白或通道蛋白进入植物细胞内。例如，小麦的LCTI蛋白在酿酒酵母中表达能够介导Cd2+流入细胞内，并使酵母细胞对Cd2+高度敏感，这种Cd2+高度敏感性可能是由于LCTI蛋白对Cd2+吸收所造成的。另外，金属转运蛋白的Nramp家族也具有能够将Cd2+转运至植物细胞内的功能。酿酒酵母Nramp家族成员SMF1和SMF2蛋白不但能够转运Mn2+而且能够转运Cu2+、Co2+和Cd2+。目前研究表明，镉元素从地下部向地上部的转运是借助于膜转运蛋白进行的，例如P1B型ATPase亚家族成员HMA。HMA蛋白家族可以根据转运功能分为两类，即Cu/Ag转运泵和Zn/Cd/Co/Pb转运泵。AtHMA4拟南芥中克隆的第一个编码HMA的基因，该基因参与Zn2+的和Cd2+从根部向地上部的转运。过表达AtHMA4不仅提高植物对Zn2+和Cd2+的耐性，而且增加上述金属从根向地上部的转移率。可见AtHMA4具有从根部向地上部转运的功能。国际上一些知名烟草公司和研究机构正采用生物技术和基因工程技术对烟草品种进行改良，以提高烟草对镉的抗性，减少烟草对土壤镉的吸收和转运。我国也提出了无公害优质烟的开发计划，为烟草重金属危害的研究提供了新的契机。随着烟草镉污染研究的深入，必将使我国烟草镉污染控制迈上了新的台阶，为我国烟叶的健康和可持续发展奠定基础。因此，开发一种利用生物技术手段降低烟草镉转运率（叶片镉含量/根镉含量）的候选基因，通过基因操作减少烟叶镉含量是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种烟草镉转运基因NtHMA4；本专利技术的第二目的在于提供所述烟草镉转运基因NtHMA4的克隆方法；本专利技术的第三目的在于提供所述烟草镉转运基因NtHMA4的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的，所述的烟草镉转运基因NtHMA4核苷酸序列为SEQID：No.1所示。本专利技术的第二目的是这样实现的，所述烟草镉转运基因NtHMA4的克隆方法包括以下步骤：A、确定NtHMA4基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtHMA4基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。本专利技术的第三目的是这样实现的，所述的烟草镉转运基因NtHMA4用于降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率。本专利技术利用RACE技术从烟草中得到一个烟草镉转运基因NtHMA4，具体步骤为：以烟草基因组数据库（行业内部数据库）基因Ntom0672570为核心序列设计RACE引物，3′RACE基因特异引物为AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA，5′RACE基因特异引物为CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA。克隆基因末端RACE试剂盒为ClontechSmartRACEcDNAAmplificationKit，反应根据试剂盒说明书进行。3′端扩增到600bp左右的片段，5′端扩增到500bp左右的片段。回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA4全长cDNA。利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtHMA4基因的过表达和RNAi植株，对NtHMA4进行功能验证，结果表明NtHMA4基因具有将镉从烟草根部转运到叶片的功能。NtHMA4基因的发现，为通过调控基因的表达，控制烟叶重金属镉含量，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。附图说明图1为利用引物对NtHMA4F/NtHMA4R扩增NtHMA4基因结果，扩增产物4377bp；图2为pBI121-NtHMA4载体PCR鉴定，所用引物对为NtHMA4F/NtHMA4R，扩增产物为4377bp；图3为pBI121-NtHMA4载体测序验证，灰色部分为过表达载体中部分基因序列斜体部分为载体序列；图4为NtHMA4基因RNAi载体片段PCR扩增结果，所用引物对为HMARNAiF/HMARNAiR，扩增产物为369bp；图5为RNAi载体pBI121-pQLi-NtHMA4的酶切验证，XbalI和SacI双酶切后可以将1500bp左右的反向重复单元切下；图6为NtHMA4RNAi烟草植株镉转移率，VectorControl为转空载体对照，其余为转基因植株；图7为NtHMA4过表达烟草植株镉转移率，VectorControl为转空载体对照，其余为转基因植株。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的烟草镉转运基因NtHMA4核苷酸序列为SEQID：No.1所示，编码的氨基酸序列为SEQID：No.2所示。所述的烟草镉转运基因NtHMA4来源于绒毛状烟草。本专利技术所述所述的烟草镉转运基因NtHMA4的克隆方法，包括以下步骤：A、确定NtHMA4基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtHMA4基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。所述的步骤A包括如下步骤：（1）利用同源基因拟南芥AtHMA4序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA4的EST序列（NCBI号：FG135138.1）；（2）利用FG135138.1比对烟草基因组数据库（行业内部数据库），获得一个基因序列（Ntom0672570），根据此序列设计RACE引物，克隆基因末端RACE试剂盒为ClontechSmartRACEcDNAAmplificationKit，反应根据试剂盒说明书进行。3′端扩增到500~700bp的片段，5′端扩增到400~600bp的片段。回收后进行测序；（3）测序结果与核心序列拼接获得NtHMA4全长cDNA。其序列如SEQIDNO.1所示。其中，步骤（2）所述的RACE引物为：3′RACE基因特异引物：5′-AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3′；5′RACE基因特异引物：5′-CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3′。所述步骤C的特异性引物为：正向引物：NtHMA4F：5′-CTTCCTTAGAGTAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草镉转运基因NtHMA4，其特征在于所述的烟草镉转运基因NtHMA4核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种烟草镉转运基因NtHMA4的应用，所述烟草镉转运基因NtHMA4核苷酸序列如SEQID：No.1所示；其特征在于用于获得降低镉从烟草根部转运到烟叶转运率的转基因植株，包括如下步骤：A、构建过表达载体或RNAi载体：（1）过表达载体构建：a、根据pBI121载体序列酶切位点，利用PrimerPremier5.0软件设计出构建NtHMA4基因过表达的引物对：正向引物：5′-GGGTGGATCCCTTCCTTAGAGTAGAGTGTAGA-3′；反向引物：5′-TAATGAGCTCCTACTCTATGACAATTTCTGATAA-3′；正向引物中GGATCC处、反向引物中GAGCTC处为酶切位点；b、以NtHMA4基因阳性克隆DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL，包括：200ngcDNA，1×PhusionHF反应缓冲液，10mMdNTP，2U的Phusion®High-FidelityDNAPolymerase，加入正向引物、反向引物各1μM，PCR反应在Mastercycler®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，10秒，60℃，20秒，72℃，2min，40个循环；72℃延伸7min；c、双酶切体系：反应总体积为40μL，含PCR纯化后的产物10μL，10×NEBBuffer1.14μL，BamHI和SacI各2μL，灭菌双蒸水22μL，37℃酶切过夜后纯化；d、pBI121载体的双酶切体系：反应总体积为40μL，含纯化的pBI121质粒DNA10μL，10×NEBBuffer1.14μL，BamHI和SacI各2μL，灭菌双蒸水22μL，37℃酶切过夜后纯化；e、连接反应体系中NtHMA4基因与pBI121载体的摩尔比为5:1，反应总体积为10μL，其中：10×连接Buffer1μL，T4DNA连接酶1μL，NtHMA4基因双酶切片段6μL，pBI121载体双酶切片段2μL；16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌菌种DH5α；在含有卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上筛选阳性克隆，抽提质粒后进行PCR及酶切鉴定，得载体pBI121-NtHMA4；（2）RNAi载体构建a、以pQLi载体为中间载体、pBI121为表达载体构建NtHMA4基因的RNAi载体，构建引物为：HMARNAiF：CATTCTAGAGAGCTCGGATCCGAATCAAGCAAGATTAGAAGCA；HMARNAiR：TCAACTAGTGATATCCTCGAGAGTGATGACATAGCAGCAGT；HMARNAiF中TCTAGAGAGCTCGGATCC分别为XbaI、SacI、BamHI酶切位点；HMARNAiR中ACTAGTGATATC分别为SpeI、EcoRV酶切位点；b、以NtHMA4基因阳性克隆DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL，包括：200ngcDNA，1×PhusionHF反应缓冲液，10mMdNTP，2U的Phusion®High-FidelityDNAPolymerase，加入正向引物、反向引物各1μM，PCR反应在Mastercycler®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，10秒，60℃，20秒，72℃，2min，40个循环；72℃延伸7min；c、NtHMA4基因RNAi正向片段与pQLi载体连接：利用BamHI和EcoRV分别双酶切纯化的PCR产物和pQLi载体，双酶切体系：反应总体积为40μL，含PCR纯化后的产物10μL，10×NEBBuffer1.14μL，BamHI和EcoRV各2μL，灭菌双蒸水22μL，37℃酶切过夜后纯化；pQLi载体的双酶切体系：反应总体积为40μL，含纯化的pQLi载体10μL，10×NEBBuffer1.14μL，BamHI和EcoRV各2μL，灭菌双蒸水22μL，37℃酶切过夜后纯化；酶切后进行回收纯化并进行连接，连接反应体系中RNAi正向片段和pQLi的摩尔比为5:1，反应总体积为10μL，其中：10×连接Buffer1μL，T4DNA连接酶1μL，RNAi正向片段6μL，pQLi载体双酶切片段2μL；16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌菌种DH5α提取质粒进行酶切鉴定；d、NtHMA4基因RNAi反向片段与连接有正向片段的pQLi载体连接：SacI和SpeI分别双酶切RNAi反向片段与连接有正向片段的pQLi载体，酶切后回收纯化并进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α细胞，转化子抽提后进行酶切验证，得到中间载体pQLi-HMA4；e、利用XbaI和SacI分别双酶切pBI121和pQLi-HMA4载体，回收pBI121大片段和pQLi-HMA4载体酶切后1000bp左右的片段，进行连接，连接后转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒进行酶切验证，得到载体pBI121-pQLi-NtHMA4；B、农杆菌转化：从-80℃冰箱中取出2份农杆菌感受态细胞，冰上溶解，分别加入重组表达载体pBI121-NtHMA4、pBI121-pQLi-NtHMA4；将2份混合物放入液氮速冻1min，转入37℃水浴5min，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文正，王丙武，高玉龙，宋中邦，曾建敏，张家瑞，孔光辉，李永平，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南;53