突变型β葡糖苷酶、生物质分解用酶组合物和糖液的制造方法技术

本发明专利技术提供在生物质存在下活性高、且比现有酶热稳定高的新β葡糖苷酶。一种β葡糖苷酶，其特征在于，选自相对于亲β葡糖苷酶的氨基酸Glu39、Asp169、Arg170、Arg220、Tyr227、Glu330中的至少3个以上的氨基酸缺失和/或向其他氨基酸置换，且显示纤维二糖分解活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新的β葡糖苷酶、包含该β葡糖苷酶的生物质分解用酶组合物、和使用它们来水解来源于纤维素的生物质的糖液的制造方法。
技术介绍
纤维素的糖化有各种方法，但开发能量使用量少且糖收率高的酶糖化法已经成为主流。如果将作为纤维素分解酶的纤维素酶大致分类，则分为作用于纤维素的结晶区域的纤维二糖水解酶、从纤维素分子链内部开始作用而降低分子量的内切葡聚糖酶。已知这些纤维素酶受到作为生成物之一的纤维二糖阻抑。另外β_葡糖苷酶是作用于水溶性寡糖或纤维二糖，催化其β_糖苷键的水解反应的酶。特别是，β_葡糖苷酶是用于充分地获得作为发酵原料有用的葡萄糖所必需的酶。另外，已知纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶由于纤维素分解所生成的纤维二糖的积累而发生反应阻抑。即，β_葡糖苷酶能够大幅降低由纤维素分解而生成的纤维二糖的积累，因此具有大幅提高纤维素分解效率这样的效果。纤维素在草本系植物、木本系植物中大量含有，因此将这些植物总称为含纤维素的生物质。含纤维素的生物质中除了纤维素之外，还包含木聚糖、阿拉伯聚糖等半纤维素、和木质素。特别是已知由于含纤维素的生物质中所含的木质素是芳香族系的高分子化合物，因此在使用来源于丝状菌的纤维素酶的酶糖化中发挥阻抑作用。关于由木质素产生的来源于丝状菌的纤维素酶的阻抑机制目前尚未完全阐明，据说纤维素酶吸附于木质素而分解效率降低是要因之一(非专利文献I)。`耐热性酶由于稳定性高、即使在高温条件下也长期保持活性，因此被研究了作为产业用酶的应用。确认了这样的耐热性酶在嗜热菌、或超嗜热菌所具有的酶中更多地存在。关于耐热性的葡糖苷酶，已经从数种嗜热菌或超嗜热菌中鉴定出，具体地，从强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)、掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)、硫横矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)等微生物中鉴定出了耐热性的β_葡糖苷酶。特别是公开了来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)的β葡糖苷酶形成单体(非专利文献2)、来源于硫磺矿硫化叶菌(sulfolobussolfataricus)和强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)的β葡糖苷酶形成4聚体(非专利文献3、非专利文献4)，但它们的结构与其功能的关系不明确。现有技术文献专利文献专利文献1:国际公开第2005/093072号公报非专利文献非专利文献1:Hetti P.等，Journal of Biotechnology, 107，65-72 (2004)非专利文献2:Christian P.等，Trichoderma and GliocladiumiBasicBiology, Taxonomy and Genetics., vol.1, 121-138 (1998)非专利文献3:0hba H.等，Biosc1.Biotech.Biochem.，59，1581-1583 (1995)非专利文献4:Bauer MW.等，J.Biol.Chem.，vol.271，39，23749-23755 (1996)
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的课题在于提供高度地保持在含纤维素的生物质的水解中的酶活性的β葡糖苷酶。用于解决课题的方法本【专利技术者】们为了解决上述课题，在具有序列号I所示的氨基酸序列的现有的β葡糖苷酶(以下在本说明书中称为“亲β葡糖苷酶”)的特定位置导入氨基酸突变，作为具有其功能被改良了的性质的突变体成功地获得了新的β葡糖苷酶。详细地，本【专利技术者】们着眼于亲β葡糖苷酶的三维结构，通过蛋白质晶体结构分析特定了与其4聚体的形成相关的氨基酸，通过对该氨基酸选择性地施加突变，从而成功地获得了 4聚体形成被不稳定化了的新β葡糖苷酶。并且发现，本新β葡糖苷酶特别是在含纤维素的生物质的水解中具有优异的特性。即，本专利技术包含以下构成。[I]突变型β葡糖苷酶，其特征在于，在各单体之间形成氢键或离子键的氨基酸的位置，具有使β葡糖苷酶的4聚体形成不稳定化的突变，并且，该突变型β葡糖苷酶具有与野生型相比同等或更高的纤维二糖分解活性。[2]根据[I]的突变型β葡糖苷酶，具有与序列号I的氨基酸序列有90%以上的序列同一性的氨基酸序列，在该有90 %以上的序列同一性的氨基酸序列中，包含与选自序列号I的氨基酸序列的第39位的谷氨酸、第169位的天冬氨酸、第170位的精氨酸、第220位的精氨酸、第227位的酪氨酸和第330位的谷氨酸中的至少3个以上的氨基酸相当的氨基酸的突变。。[3]根据[I]或[2]的突变型β葡糖苷酶，具有与序列号I的氨基酸序列有90%以上的序列同一性的氨基酸序列，在该有90%以上的序列同一性的氨基酸序列中，包含与选自序列号I的氨基酸序列的第39位的谷氨酸、第169位的天冬氨酸、第170位的精氨酸、第220位的精氨酸、第227位的酪氨酸和第330位的谷氨酸中的至少3个以上的氨基酸相当的氨基酸向具有中性侧链的氨基酸的置换。[4]根据[I]~[3]的任一项的突变型β葡糖苷酶，具有与序列号I的氨基酸序列有90%以上的序列同一性的氨基酸序列，在该有90%以上的序列同一性的氨基酸序列中，包含与序列号I的氨基酸序列的第170位的精氨酸、第220位的精氨酸和第227位的酪氨酸相当的氨基酸向具有中性侧链的氨基酸的置换。[5]根据[3]或[4]的突变型β葡糖苷酶，具有中性侧链的氨基酸从丙氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸中选择。[6]根据[I]~[5]的任一项的突变型β葡糖苷酶，具有与序列号I的氨基酸序列有90%以上的序列同一性的氨基酸序列，在该有90%以上的序列同一性的氨基酸序列中，包含与序列号I的氨基酸序列的第170位的精氨酸相当的氨基酸向丙氨酸的置换、与序列号I的氨基酸序列的第220位的精氨酸相当的氨基酸向丙氨酸的置换和与序列号I的氨基酸序列的第227位的酪氨酸相当的氨基酸向苯丙氨酸的置换。[7]根据[I]~[6]的任一项的突变型β葡糖苷酶，包含序列号14所示的氨基酸序列。[8]根据[I]~[7]的任一项的突变型β葡糖苷酶，进一步包含与选自序列号I的氨基酸序列的第440位的亮氨酸、第448位的精氨酸、第449位的谷氨酸、第459位的谷氨酸中的I个以上的氨基酸相当的氨基酸的突变。[9]根据[8]的突变型β葡糖苷酶，包含选自与序列号I的氨基酸序列的第448位的精氨酸相当的氨基酸向具有中性侧链或酸性侧链的氨基酸的置换、与序列号I的氨基酸序列的第449位的谷氨酸相当的氨基酸向具有中性侧链或碱性侧链的氨基酸的置换和与序列号I的氨基酸序列的第459位的谷氨酸相当的氨基酸向具有中性侧链或碱性侧链的氨基酸的置换中的I个以上的置换。[10]根据[8]或[9]的突变型β葡糖苷酶，包含序列号35~38的任一者所示的氨基酸序列。[11]DNA，编码[I]~[10]的任一项的突变型β葡糖苷酶。[12]根据[11]的DNA，包含序列号20、序列号31~34的任一者所示的碱基序列。[13]表达载体， 包含[11]或[12]的DNA0[本文档来自技高网...

【技术保护点】
突变型β葡糖苷酶，其特征在于，在各单体之间形成氢键或离子键的氨基酸的位置，具有使β葡糖苷酶的4聚体形成不稳定化的突变，并且，该突变型β葡糖苷酶具有与野生型相比同等或更高的纤维二糖分解活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.07.14 JP 2011-1557921.突变型β葡糖苷酶，其特征在于，在各单体之间形成氢键或离子键的氨基酸的位置，具有使β葡糖苷酶的4聚体形成不稳定化的突变，并且，该突变型β葡糖苷酶具有与野生型相比同等或更高的纤维二糖分解活性。2.根据权利要求1所述的突变型β葡糖苷酶，具有与序列号I的氨基酸序列有90%以上的序列同一性的氨基酸序列，在该有90%以上的序列同一性的氨基酸序列中，包含与选自序列号I的氨基酸序列的第39位的谷氨酸、第169位的天冬氨酸、第170位的精氨酸、第220位的精氨酸、第227位的酪氨酸和第330位的谷氨酸中的至少3个以上的氨基酸相当的氨基酸的突变。3.根据权利要求1或2所述的突变型β葡糖苷酶，具有与序列号I的氨基酸序列有90%以上的序列同一性的氨基酸序列，在该有90 %以上的序列同一性的氨基酸序列中，包含与选自序列号I的氨基酸序列的第39位的谷氨酸、第169位的天冬氨酸、第170位的精氨酸、第220位的精氨酸、第227位的酪氨酸和第330位的谷氨酸中的至少3个以上的氨基酸相当的氨基酸向具有中性侧链的氨基酸的置换。4.根据权利要求1~3的任一项所述的突变型β葡糖苷酶，具有与序列号I的氨基酸序列有90%以上的序列同一性的氨基酸序列，在该有90%以上的序列同一性的氨基酸序列中，包含与序列号I的氨基酸序列的第170位的精氨酸、第220位的精氨酸和第227位的酪氨酸相当的氨基酸向具有中性侧链的氨基酸的置换。5.根据权利要求3或4所述的突变型β葡糖苷酶，具有中性侧链的氨基酸从丙氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸中选择。6.根据权利要求1~5的任一项所述的突变型β葡糖苷酶，具有与序列号I的氨基酸序列有90%以上的序列同一性的氨基酸序列，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗原宏征，山田胜成，石川一彦，三岛由美子，和田康史，门祐示，
申请(专利权)人：东丽株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP