本发明专利技术涉及蛇足石杉植物内生真菌，其生物分类和分子生物学鉴定为木霉菌（Trichodermasp.）L44，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?NO:M2013198。本发明专利技术还提供了其在制备石杉碱甲中的应用。本发明专利技术为石杉碱甲的来源提供了一个新的微生物。本发明专利技术发明专利技术的微生物，有生长繁殖迅速，不受季节，气候等外界环境的限制，产量提升空间大等优势。能对药用植物蛇足石杉的野生资源进行有效的保护，避免过度的采挖。
【技术实现步骤摘要】
蛇足石杉植物内生真菌及其在制备石杉碱甲中的应用
本专利技术属于药用植物的微生物提取和产物培养，具体涉及从蛇足石杉中分离内生真菌和利用内生真菌发酵生产石杉碱甲。
技术介绍
大量的流行病学调查资料显示，全球人口的老龄化己成世界趋势，阿尔茨海默病又称阿尔茨海默病性老年痴呆，一般简称Alzheimer病(Alzheimer’s disease, AD),是痴呆的最主要类型，当仁不让地成为了现代社会的“常见病”。据Ellis等研究表明，60岁以上老年人发生痴呆的比率为6-12%;随着年龄的增长，发病的可能性也明显增加，如对于85岁以上的老人来说，痴呆的发生率高达20-40%。尽管痴呆有多种类型，但50%以上属于AD。目前，全世界AD的发病人数高达2000万。在日本65岁以上者老年痴呆症发病率约为3.8%，其中女性患病率高于男性。在美国AD患病人数已达500万，并预期在2050年将增加至1000万，其中每年为AD患者的药物及护理所支出的费用高达1500亿美元，该病已成为除心血管病、癌症和脑卒中以外危害人民健康的第4大杀手。石杉碱甲，是我国首次从蕨类植物石杉科石杉属植物蛇足石杉中分离出的一种生物碱，其化学结构独特，与美国FDA批准的其他AD治疗药物(Tacrine、Don印ezil、Rivastigmine、Galanthamine等)相比,石杉碱甲具抑制AChE活性高、毒副作用低、可提高记忆力和保护心血管等特点，成为治疗AD最有前景的天然药物[7]。目前石杉碱甲生产仅能从蛇足石杉等石松属植物中提取，存在严重的原料短缺和生态环境破坏等问题。由于石松属植物植株矮小(l(T30cm)，生境要求苛刻，生长缓慢(自然条件下12cm成苗生长需10~15年)，石杉碱甲含量极低(约0.02%左右)，野生资源十分有限(我国为蛇足石杉主产区，实际商业可采量仅200吨/年)，收集非常困难，无法满足日益增长的需求。为解决石杉碱甲药源问题，人们对蛇足石杉人工栽培技术进行了探索，但令人遗憾的是，其人工栽培技术一直无法突破。同时，许多机构开展了化学合成及组织细胞培养技术研究。石杉碱甲结构复杂，反应步骤多、反应条件苛刻、得率低、环境污染大，同分异构体因无法分离而导致合成物活性低，化学合成法现无法应用于商业化生产。蛇足石杉等石松属植物愈伤组织和细胞培养极其困难，自1957年开展石松属植物组织培养研究以来，研究进展极其缓慢，直到2008年Ma和Gang才实现了粗糙马尾杉0°.体外繁殖。利用植物内生真菌发酵生产植物天然药物成为一种可供选择的有效途径。如能采用内生真菌发酵生产石杉碱甲，不仅能有效地解决HupA的药物来源、降低药品价格，而且可有效地保护生态环境。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种蛇足石杉植物内生真菌，同时还提供一种采用该菌种发酵生产高产石杉碱甲的方法，以缓解目前石杉碱甲临床用药供给严重不足的局面。本专利技术的技术方案如下:蛇足石杉植物内生真菌，经18S rDNA和微生物学鉴定为木霉菌(Trichoderma sp.)L44，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间2013年5 月 9 日，保藏号 CCTCC Ν0:Μ 2013198。本专利技术所属的菌株(Trichoderma sp.) L44,固体培养特征为: 采用PDA培养基培养L44菌株，菌落形态为:28°C培养2_3天菌落直径为50mm，培养到5-6天可以铺满整个培养皿，菌落在生长2-3天颜色为白色，菌丝细丝状，5-6天生长至整个平皿。菌落中间有细小的深绿色颗粒状，培养至6-7天，培养菌落上布满绿色颗粒状物，在PDA培养基上反面为乳白色，菌落边缘一圈略显淡黄色。菌丝形态:菌丝平滑，分枝，无色有隔菌丝。菌株(Trichoderma sp.) L44的分生孢子梗粗，无色，直径为10-15 μ m ;分生孢子顶囊近乎球形，直径为50-65 μ m，产孢结构单层或双层，分生孢子球形至近球形，直径为2.5-5 μ m0本专利技术以(Trichoderma sp.) L44为发酵生产菌株，培养条件为: 以PDA为培养基，该培养基配方为:常规方法，土豆200g，加水煮沸过滤得滤液，蔗糖20g，加水定容到lL，pH6.5。发酵条件:温度28°C，接种量10%，种龄48h，转速150r/min，发酵时间7天。发酵结束后对发酵液和菌丝进行化学提取，分离可得石杉碱甲及其类似物。本专利技术所述的蛇足石杉内生真菌(Trichoderma sp.)L44，基因登录号为KF018088ITS碱基序列为:`GAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA本专利技术的效果:本专利技术为石杉碱甲的来源提供了一个新的微生物。本专利技术专利技术的微生物，有生长繁殖迅速，不受季节，气候等外界环境的限制，产量提升空间大等优势。能对药用植物蛇足石杉的野生资源进行有效的保护，避免过度的采挖。【附图说明】图1为本专利技术所述木霉菌(Trichoderma sp.) L44的菌落形态。图2为本专利技术所述木霉菌(Trichoderma sp.) L44在400倍显微镜下的菌丝形态。图3和图4为本专利技术所述木霉菌(Trichoderma sp.)L44在电镜下的孢子形态。图5为本专利技术所述木霉菌(Trichoderma sp.)L44发酵提取物的薄层图。图6为本专利技术所述木霉菌(Trichoderma sp.)L44发酵提取物高效液相图谱，A为石杉碱甲标准品色谱图。图7为本专利技术所述木霉菌(Trichoderma sp.) L44发酵提取物高效液相图谱，B为木霉菌(Trichoderma sp.) L44发酵提取物色谱图。【具体实施方式】以下结合附图实施例对本专利技术作进一步描述。步骤一:产石杉碱甲木霉菌(Trichoderma sp.)L44的分离筛选 从浙江省杭州市，天目山采集野生蛇足石杉植株，带回实验室培养。选本文档来自技高网...
【技术保护点】
蛇足石杉植物内生真菌，其特征在于：生物分类和分子生物学鉴定为木霉菌（Trichoderma?sp.）L44，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?NO:?M2013198。
【技术特征摘要】
1.蛇足石杉植物内生真菌，其特征在于:生物分类和分子生物学鉴定为木霉菌(Trichoderma sp.) L44，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2013198。2.根据权利I所述的蛇足石杉植物内生真菌，其特征在于:其在PDA培养基培养的菌落形态为:28°C培养2-3天菌落直径为50mm，培养到5_6天可以铺满整个培养皿，菌落在生长2-3天颜色为白色，菌丝细丝状，5-6天生长至整个平皿， 菌落中间有细小的深绿色颗粒状，培养至6-7天，培养菌落上布满绿色颗粒状物，在PDA培养基上反面为乳白色，菌落边缘一圈略显淡黄色。3.根据权利I所述的蛇足石杉植物内生真菌，其特征在于:菌丝平滑，分枝，无色有隔菌丝， 菌株的分生孢子梗粗，无色，直径为10-15μπι;分生孢子顶囊近乎球形，直径为50-65 μ m，产孢结构单层或双层，分生孢子球形至近球形，直径为2.5_5 μ m。4.根据权利I所述的蛇足石杉植物内生真菌，其特征在于:基因登录号为KF018088ITS碱基序列为:GAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTT...
【专利技术属性】
技术研发人员：董丽辉，凌庆枝，
申请(专利权)人：浙江医药高等专科学校，
类型：发明
国别省市：
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