用于PEI介导转染的聚酯壳层的熔融超声组装制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用作高分子量(HMW)PEI等阳离子聚合物纳米基因转染体系保护壳层的熔融超声自组装制备技术，该保护壳层主要成分是基于聚甘油醇和聚乳酸合成的具有较好生物兼容性能的超支化聚酯。本发明专利技术公开了上述保护壳层的组装制备技术，该壳层可以有效保护PEI25k/DNA等基因传递体系以及细胞膜，通过在PEI25k/DNA表面组装形成可缓慢生物降解的固化壳层隔离PEI25k与细胞膜及细胞因子，延长其在胞内停留时间，同时获得延长的高效转染水平和降低的细胞毒性，从而可用作PEI等阳离子聚合物转基因体系的保护载体，应用于相应的非病毒型纳米基因传递体系介导的基因治疗。

【技术实现步骤摘要】
用于PEI介导转染的聚酯壳层的熔融超声组装制备方法
本专利技术涉及用于基因转染的高分子材料
，具体是涉及一种用于PEI等阳离子聚合物介导高效转染的聚酯保护壳层的熔融超声自组装制备技术。
技术介绍
当前，我国肿瘤发病率呈现逐年上升趋势，因而亟待建立针对恶性肿瘤的治疗体系。在国际上，基因治疗已被发展用于对抗基因缺失或突变的策略，成为肿瘤安全治疗策略中的研究热点。各种高效和低毒的基因运载体随之被积极地研究、开发，和应用。包括多种阳离子聚合物在内的生物高分子材料由于具有介导转基因表达的能力，已成为取代具有潜在风险的病毒载体的新一代生物安全转基因材料。在众多非病毒阳离子转基因载体中，如磷酸钙、阳离子脂类/脂质体、壳聚糖、聚乙烯亚胺PEI，以及基于特殊技术的材料中，高分子量(HMW) PEI因具有出色的基因传递能力广泛的为人所知，而其细胞毒性亦不可忽视。PEI25k等阳离子聚合物可以通过两种不同机制对细胞产生毒性，即早期(30分钟)整合至细胞膜导致细胞坏死病变、24小时候激活线粒体介导的凋亡程序。能够不影响PEI25k等阳离子聚合物负载DNA能力和实现高效转染的二级保护载体，由于其直接在阳离子聚合物/DNA复合物表面固化成层，起到隔离PEI25k/DNA等复合物与细胞膜及细胞因子的作用，因此是一种简单易行降低转染毒副作用、增强外源蛋白可控制高效表达的新思路，然而，这方面的报道并不多见，通常通过复杂的化学反应共价修饰等方法达到降低HMW PEI等阳离子聚合物毒性的目的，相对耗时，并且可能因为减少PEI25k等聚合物的功能基团而削弱其结合DNA的能力。因而，实际应用于PEI等阳离子聚合物高效转染的保护型载体亟待开发。已有文献报道，超支化聚酯聚甘油醇-聚乳酸在37°C下呈现固体，特定条件下具有两亲性。在此基础上，我们开发了用于阳离子复合物高效转染的保护二级载体(壳层)的熔融超声自组装技术，该壳层形式的保护载体可保护细胞和控制胞内外源DNA释放，从而降低细胞毒性，达到控制外源蛋白高效表达的目的。
技术实现思路
本专利针对HMW PEI等阳离子聚合物的细胞毒性机制，设计了由具有微弱负电荷的超支化固体脂生物材料聚甘油醇-聚酯(PG-PLA)组装形成的保护壳层，其形成过程是，在熔融超声充分分散于挥发性有机溶剂/水的条件下发挥聚甘油醇-聚酯两亲性，在不破坏DNA活性和有效变性细菌等生物污染源蛋白组分的条件下促使PG-PLA在PEI25k/质粒纳米复合物表面共组装形成保护层，在蒸馏、挥发有机相及降温过程中使该保护层凝固温相对稳定的壳层，从而有效隔离HMWPEI与细胞膜及细胞因子的接触、延迟HMW PEI从细胞清除、控制质粒DNA在细胞内的释放及蛋白表达时相。该纳米体系将对于解决HMW PEI等阳离子聚合物的毒性及转染瞬时性有积极的推动作用，在其它转基因体系及药物传递体系中也有很好的应用前景。【具体实施方式】下面将实施例，对本专利技术的【具体实施方式】做进一步详细描述。以下实施例将有助于说明本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。IPG-PLA合成与鉴定多聚甘油醇PG(48mg)和丙交酯(222mg)混于彻底干燥、经硅烷化处理并有搅拌子的反应管中。加入溶解于20yL干燥甲苯的Sn(0ct)2(0.01mg)。反应管抽真空充氮气反复三次，真空条件下封管，于140°C油浴锅中反应48小时。将产物溶于DMS0，于室温在去离子水中透析，冷冻干燥获得PG-PLA。以DMS0-d6作为溶剂，对PG-PLA进行1HNMR核磁图谱分析。采用KBr压片纸样法对PG-PLA作傅立叶变换红外光谱(FT-1R)分析。采用四氢呋喃作为溶剂，应用体积-排除色谱偶联多角激光散射(SEC-MALLS)法检测PG-PEI分子量。以数码熔点仪测定PG-PLA的熔点。经检测，该壳层基本成分为聚甘油醇和聚乳酸，分子量为1.08 X IO5Da,玻璃化温度为62°C在75°C下将0.2mgPG-PLA熔化分散至1.5mL去离子水。在梯度下降的温度下用马尔文公司的粒径仪测定颗粒粒径、Zeta-电位和导电率。2PG_PLA/PEI25k 复合物的检测用罗丹明B和FITC标记PG-PLA聚合物和PEI25k，操作如下。PG-PLA(IOmg)和RhodamineB (2.5mg)溶解于 5mLDMF，采用 DCC (1.5mg)和 DMA P (0.8mg)分别作为偶联剂和催化剂。PEI25k(15mg)和 FITC (12.3mg)溶解于 5mLDMF, DCC (8.5mg)和 NHS (4.8mg)分别用作偶联剂和羧基活化剂。60°C反应24小时。室温下蒸馏水中充分透析获得PG-PLA-R和PEI25k-F，产物于冷冻干燥仪中冻干。PG-PLA-R (2 μ g/μ L溶于30%丙酮)，PEI25k_F(3 μ g/μ L溶于去离子水)，以质量比(w/w)为I超声混和，敞口静置30分钟，加至DMEM培养基(高糖，10%血清)。在共聚焦`激光扫描显微镜(CLSM)下观察颗粒的共组装。3PG-PLA/PEI25k复合载体在细胞内的滞留时间测定10 μ LPG-PLA-R(lmg/mL，62-90°C下熔融后以 30% 丙酮溶解)、PEI25k_F(lmg/mL，去离子水溶解)，或20 μ L上述等体积溶液迅速混和经超声混匀，室温下静置30分钟使PG-PLA-R与PEI25k-F复合，同时使初始浓度较高的丙酮挥发至无细胞毒性，加至NIH3T3细胞的24小时培养物中，培养6-72小时后，用PBS(pH=7.4)清洗细胞两次，加入适量DMEM培养基。用共聚焦激光扫描显微镜观察细胞。结果表明，保护载体PG-PLA、复合二元载体PG-PLA/PEI25k在细胞内的滞留时间均达到72小时以上，而常规基因载体PEI25k胞内无明显停留(〈24小时)，在24-72小时均以包涵体形式被排除至细胞外。4PG-PLA/PEI25k/DNA 复合物的形成各组分共混形成的纳米颗粒粒径分布和表面Zeta-电位于37°C在缓冲液中测定。待测定溶液配制如下=PG-PLA(0.lmg/mL62-9(TC熔融后超声分散于30%乙醇溶液)，PEI25k/DNA(w/w=l.3;N/P=10;DNA溶解于试剂盒提供的缓冲液；PEI25k以0.2mg/mL溶解于去离子水，振荡混匀)，上述两种溶液按不同体积比迅速混合，采用反复振荡结合超声的方法混匀。PG-PLA/PEI25k/DNA(pG L3_Luc)复合物的形态在透射电子显微镜下观察。将2 μ LPG-PLA/PEI25k/DN A的复合物溶液加至铜网支撑的碳膜上。空气中放置片刻，以磷钨酸溶液染色，晾干样品，电镜下观察颗粒形貌。结果表明，在该实施条件下，PG-PLA/PEI25k/DNA形成具有保护壳层结构的核-壳纳米复合体系。5PG-PLA/PEI25k/DNA 的细胞毒性以上述方法制备的PG-PLA/PEI25k/DNA(pGL3-Luc)复合物的细胞毒性用M TT法测定。将293T细胞种于24孔板，培养24小时以后加入复合物。在DMEM(10%血清)中培养72小时。小心吸去培养基，用PBS(pH7.4)清洗细胞。向各孔加入新鲜DMEM(ImL本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于PEI介导转染的聚酯壳层的熔融超声组装制备方法，其特征在于：基于分子末端存在丰富羟基的超支化聚酯，在62?90℃和有机溶剂的条件下，阳离子聚合物/DNA复合物的表面通过疏水作用自组装形成保护层。

【技术特征摘要】
1.用于PEI介导转染的聚酯壳层的熔融超声组装制备方法，其特征在于:基于分子末端存在丰富羟基的超支化聚酯，在62-90°C和有机溶剂的条件下，阳离子聚合物/DNA复合物的表面通过疏水作用自组装形成保护层。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:当该保护层与阳离子聚合物/DNA比例合适时，蒸馏或挥发有机溶剂同时降温至低于PG-PLA玻璃化温度时，原自发组装的非固态保护层在阳离子聚合物/DNA复合物表面固化为稳定的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴允昆，张蕾，
申请(专利权)人：中国科学院福建物质结构研究所，
类型：发明
国别省市：