一种虎杖发酵液中白藜芦醇的提取方法，包括以下步骤：（1）内生真菌L1孢子悬浮液制备；（2）培养基准备；（3）发酵，得虎杖发酵液；（4）提取：用乙酸乙酯分四次萃取虎杖发酵液，合并乙酸乙酯相，浓缩至干，得白藜芦醇粗提取物；（5）大孔树脂－硅胶联合层析；（6）精制，得白藜芦醇产品。本发明专利技术工艺简单，生产成本低，对环境污染小，适宜工业化生产。利用本发明专利技术对虎杖发酵液进行提纯分离，纯化后的白藜芦醇纯度可达92wt％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种白藜芦醇的提取方法，尤其是涉及。
技术介绍
白藜芦醇是一种植物抗菌素，它主要存在于葡萄的果皮、花生、桑椹、松树、寥科植物(虎杖)12科、31个属的72种植物中。白藜芦醇是生物为抵抗环境压力(如气候恶劣、微生物侵染等)而产生的化学物质，具有显著的药理和生物学作用，如抗癌、保护神经、抗衰老、抗炎症以及延长寿命等。目前，虎杖发酵液中白藜芦醇的提取方法一般为大孔树脂、硅胶或离子交换树脂单柱层析，这些传统工艺成本高，纯度低。由此可见，寻找一种低成本、纯度高的白藜芦醇提取方法，已成为目前白藜芦醇生产行业的当务之急。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种成本低的虎杖发酵液中白藜芦醇的提取方法，所提取出的白藜芦醇纯度高。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是:，包括以下步骤: Cl)内生真菌LI孢子悬浮液制备:从内生真菌LI PDA斜面上挑五环菌体于IOml生理盐水中，充分震荡； 所述内生真菌LI保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4558 (参见申请号为201110130127.1的专利申请文件)； (2)培养基准备:将新鲜虎杖粉碎至180目，按质量比虎杖1.5wt%、无水乙醇2 wt%、CMC-Na 2.5 wt%、NH4NO3 0.2 wt%、Na2HPO40.06 wt%、CaCl20.1 wt% 配制发酵培养基，调起始PH值为5.5 ; (3)发酵:先将步骤(2)中的培养基经121°C、30min湿热灭菌；再将3ml的内生真菌LI孢子悬浮液接入250ml三角瓶中，所述三角瓶中装有30mL起始pH 5.5的培养基，再在培养条件为温度28°C、转速220r/min下，发酵60h，得虎杖发酵液； (4)提取:用乙酸乙酯分四次萃取虎杖发酵液，合并乙酸乙酯相，浓缩至干，得白藜芦醇粗提取物； (5)大孔树脂一硅胶联合层析:将步骤(4)所得白藜芦醇粗提取物溶于乙醇与乙酸乙酯的混合液，所述乙醇与乙酸乙酯的混合液中，乙醇与乙酸乙酯的体积比为2:3 ;然后用滤纸过滤，弃去滤渣，得滤液；往大孔树脂柱加去离子水，当去离子水液面与大孔树脂柱顶部表面齐平时，将所得滤液加到大孔树脂柱顶部，当滤液液面没过大孔树脂柱顶部时，用乙醇与乙酸乙酯体积比为2:3的混合液作为洗脱液进行洗脱，大孔树脂层析洗脱速度为Iml /mim，收集洗脱液；再将收集的洗脱液即大孔树脂层析后的白藜芦醇混合液，加入到硅胶层析柱中，待白藜芦醇混合液渗入硅胶中，再用乙醇:乙酸乙酯体积比为4:1的乙醇与乙酸乙酯的混合液作为硅胶柱用洗脱液进行洗脱，硅胶层析洗脱速度为Iml / mim，得洗脱液； (6)精制:将步骤(5)所得洗脱液，减压浓缩，至刚好有沉淀出现，溶液变混浊时，停止浓缩，将浓缩液在4°C条件下静置24h以上析晶，得到黄色晶体，经冷冻干燥，得白藜芦醇产品O进一步，步骤(5)中，所述滤纸为精密滤纸。本专利技术之白藜芦醇的提取方法，先采用乙酸乙酯分四次萃取虎杖发酵液，以保障白藜芦醇的提取率和收率，然后采用大孔树脂一硅胶联合层析将白藜芦醇精制，确保白藜芦醇产品的质量合格，最后精制，洗脱液中自藜芦醇部分，减压浓缩，再将浓缩液静置析晶，得到黄色晶体，经冷冻干燥，得白藜芦醇产品。本专利技术工艺简单，生产成本低，对环境污染小，适宜工业化生产。利用本专利技术对虎杖发酵液进行提纯分离，纯化后的白藜芦醇可达92wt %，远远高于单独使用大孔树脂和硅胶单柱层析所得的白藜芦醇纯度。【具体实施方式】以下结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1 本实施例包括以下步骤: (1)内生真菌LI孢子悬浮液制备:从内生真菌LIPDA斜面上挑五环菌体于IOml生理盐水中，充分震荡； 所述内生真菌LI保藏于中国微生`物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4558 (参见申请号为201110130127.1的专利申请文件)； (2)培养基准备:将新鲜虎杖粉碎至180目，取180目新鲜虎杖粉末0.45g(虎杖1.5wt%)、无水乙醇 0.6g (2%)、CMC-Na0.75g (2.5%)、NH4NO30.06g (0.2%)、Na2HPO40.018g(0.06%)、CaCl20.03g (0.1%)配制成发酵培养基，pH 值为 5.5 ； (3)发酵:先将步骤(2)中的培养基经121°C、30min湿热灭菌；再将3ml的内生真菌LI孢子悬浮液接入250ml三角瓶中，所述三角瓶中装有30mL起始pH 5.5的培养基，再在培养条件为温度28°C、转速220r/min下，发酵60h，得虎杖发酵液； (4)提取:取200ml虎杖发酵液，用800ml乙酸乙酯平均分四次萃取，合并乙酸乙酯相，浓缩至干，得白藜芦醇粗提取物； (5)大孔树脂一硅胶联合层析:将步骤(4)所得白藜芦醇粗提取物溶于乙醇与乙酸乙酯的混合液，所述乙醇与乙酸乙酯的混合液中，乙醇与乙酸乙酯的体积比为2:3 ;然后用滤纸过滤，弃去滤渣，得滤液；往大孔树脂柱加去离子水，当去离子水液面与大孔树脂柱顶部表面齐平时，将所得滤液加到大孔树脂柱顶部，当滤液液面没过大孔树脂柱顶部时，用乙醇与乙酸乙酯体积比为2:3的混合液作为洗脱液进行洗脱，大孔树脂层析洗脱速度为Iml /mim，收集洗脱液；再将收集的洗脱液即大孔树脂层析后的白藜芦醇混合液，加入到硅胶层析柱中，待白藜芦醇混合液渗入硅胶中，再用乙醇:乙酸乙酯体积比为4:1的乙醇与乙酸乙酯的混合液作为硅胶柱用洗脱液进行洗脱，硅胶层析洗脱速度为Iml / mim，得洗脱液； (6)精制:将步骤(5)所得洗脱液，减压浓缩，至刚好有沉淀出现，溶液变混浊时，停止浓缩，将浓缩液在4°C条件下静置24h以上析晶，得到黄色晶体，经冷冻干燥，得白藜芦醇产品O本实施例所得产品经HPLC、以及质谱检测白藜芦醇纯度达到92%。实施例2 本实施例包括以下步骤: Cl)内生真菌LI孢子悬浮液制备:从内生真菌LI PDA斜面上挑五环菌体于IOml生理盐水中，充分震荡； 所述内生真菌LI保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4558 (参见申请号为201110130127.1的专利申请文件)； (2)培养基准备:将新鲜虎杖粉碎至180目，取180目新鲜虎杖粉末0.45g(虎杖1.5wt%)、无水乙醇 0.6g (2%)、CMC-Na0.75g (2.5%)、NH4NO30.06g (0.2%)、Na2HPO40.018g(0.06%)、CaCl20.03g (0.1%)配制成发酵培养基，pH 值为 5.5 ； (3)发酵:先将步骤(2)中的培养基经121°C、30min湿热灭菌；再将3ml的内生真菌LI孢子悬浮液接入250ml三角瓶中，所述三角瓶中装有30mL起始pH 5.5的培养基，再在培养条件为温度28°C、转速220r/min下，发酵60h，得虎杖发酵液； (4)提取:取200ml虎杖发酵液，用800ml乙酸乙酯平均分四次萃取，合并乙酸乙酯相，浓缩至干，得白藜芦醇粗提取物； (5)大孔树脂一硅胶联合层析`:将步骤(4)所得白藜芦醇粗提取物溶于乙本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种虎杖发酵液中白藜芦醇的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）内生真菌L1孢子悬浮液制备：从内生真菌L1 PDA斜面上挑五环菌体于10ml生理盐水中，充分震荡；所述内生真菌L1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?NO.4558；（2）培养基准备：将新鲜虎杖粉碎至180目，按质量比虎杖1.5wt%、无水乙醇?2?wt%、?CMC?Na?2.5?wt%、?NH4NO3?0.2?wt%、Na2HP040.06?wt%、?CaCl20.1?wt%配制发酵培养基；调起始pH值为5.5；（3）发酵：先将步骤（2）中的培养基经121℃、30min湿热灭菌；再将3ml的内生真菌L1孢子悬浮液接入250ml三角瓶中，所述三角瓶中装有30mL起始pH?5.5的培养基，再在培养条件为温度?28℃、转速?220r/min下,发酵60h，得虎杖发酵液；（4）提取：用乙酸乙酯分四次萃取虎杖发酵液，合并乙酸乙酯相，浓缩至干，得白藜芦醇粗提取物；（5）大孔树脂－硅胶联合层析：将步骤（4）所得白藜芦醇粗提取物溶于乙醇与乙酸乙酯的混合液，所述乙醇与乙酸乙酯的混合液中，乙醇与乙酸乙酯的体积比为2:3；然后用滤纸过滤，弃去滤渣，得滤液；往大孔树脂柱加去离子水，当去离子水液面与大孔树脂柱顶部表面齐平时，将所得滤液加到大孔树脂柱顶部，当滤液液面没过大孔树脂柱顶部时，用乙醇与乙酸乙酯体积比为2:3的混合液作为洗脱液进行洗脱，大孔树脂层析洗脱速度为lml／mim，收集洗脱液；再将收集的洗脱液即大孔树脂层析后的白藜芦醇混合液，加入到硅胶层析柱中，待白藜芦醇混合液渗入硅胶中，再用乙醇:乙酸乙酯体积比为4:1的乙醇与乙酸乙酯的混合液作为硅胶柱用洗脱液进行洗脱，硅胶层析洗脱速度为lml／mim，得洗脱液；（6）精制：将步骤（5）所得洗脱液，减压浓缩，至刚好有沉淀出现，溶液变混浊时，停止浓缩，将浓缩液在4℃条件下静置24h以上析晶，得到黄色晶体，经冷冻干燥，得白藜芦醇产品。...
【技术特征摘要】
1.一种虎杖发酵液中白藜芦醇的提取方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)内生真菌LI孢子悬浮液制备:从内生真菌LIPDA斜面上挑五环菌体于IOml生理盐水中，充分震荡； 所述内生真菌LI保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC N0.4558 ； (2)培养基准备:将新鲜虎杖粉碎至180目，按质量比虎杖1.5wt%、无水乙醇2 wt%、CMC-Na 2.5 wt%、NH4NO3 0.2 wt%、Na2HPO40.06 wt%、CaCl20.1 wt% 配制发酵培养基；调起始pH值为5.5 ; (3)发酵:先将步骤(2)中的培养基经121°C、30min湿热灭菌；再将3ml的内生真菌LI孢子悬浮液接入250ml三角瓶中，所述三角瓶中装有30mL起始pH 5.5的培养基，再在培养条件为温度28°C、转速220r/min下，发酵60h，得虎杖发酵液； (4)提取:用乙酸乙酯分四次萃取虎杖发酵液，合并乙酸乙酯相，浓...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘杉林，
申请(专利权)人：湖南科源生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。