一种枯草芽孢杆菌及其在水稻稻曲病防治中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌及其在水稻稻曲病生物防治中的应用技术，涉及植物病害生物防治技术领域，提供了一种对稻曲病菌生长具有明显抑菌活性的枯草芽孢杆菌T122F，采用改良的细菌发酵液体培养基培养枯草芽孢杆菌T122F，其发酵滤液能明显抑制稻曲病菌分生孢子萌发和菌丝扩展，使用枯草芽孢杆菌T122F对田间稻曲病具有较好防治效果，防治效果显著高于10%苯醚甲环唑水分散粒剂的正常使用剂量。本发明专利技术提供的枯草芽孢杆菌及其发酵液为制备防治水稻稻曲病的生物农药提供参考，本发明专利技术扩大了枯草芽孢杆菌T122F的应用范围，对保障我国水稻粮食的安全生产和增产，减少因化学农药的大量投入使用产生的环境污染等问题起着重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌及其在水稻稻曲病防治中的应用
本专利技术涉及植物病害生物防治
，更具体涉及一种枯草芽孢杆菌{Bacillus subtil is.、及其在水稻稻曲病生物防治中的应用。
技术介绍
稻曲病{Ustilaginoidea virens (Cooke) Tak)为水稻穗部的真菌病害,又称假黑穗病、绿黑穗病，俗称“丰收病”。在中国、日本、菲律宾、印度、美国、澳大利亚、埃及、英国等五大洲40多个国家的水稻生产区都有分布。稻曲病也是近10年来在我国上升的主要水稻病害，特别是近年来，该病在我国常年危害面积为560飞40万公顷，大流行年份发生与危害面积可达1000万公顷。一般田块的病穗率约为3%~5%，发病较重的田块病穗率高达90%，直接产量损失可达50%以上，有的甚至绝收，经济损失巨大。稻曲病发生不仅降低稻谷产量及米质，而且混杂于稻谷中的病粒及其病菌能产生对人畜有致畸作用的毒素，人畜食用这种稻米较多时会发生慢性中毒，影响健康。稻曲病的发生、流行及为害程度与(25~30°C)、高湿、寡日照利于病菌孢子萌发和侵染，开花期多阴天并带有降水有利于发病。选用适量的化学农药是目前防治稻曲病的主要措施。目前生产中使用的药剂很多，铜制剂和有机锡等一些农药是防治稻曲病的有效药剂，但这些药剂对即将收获的稻谷残留及其重金属对周边植物的药害、环境的安全及人体的伤害均是令人关注的问题。目前国内外对稻曲病的生物防治研究较少，生产上发现用于防治水稻纹枯病的纹曲宁对水稻稻曲病具有一定的防治效果，纹曲宁是由枯草芽孢杆菌与井岗霉素进行复配而成的微生物农药，但纹曲宁中的井岗霉素是纹枯病的有效药剂，对稻曲病防治效果不理想，推测起防治作用的可能是枯草芽孢杆菌。稻曲病菌的孢子有三种类型，分别是厚垣孢子、薄壁分生孢子和子囊孢子，厚垣孢子和子囊孢子萌发后均可形成薄壁的分生孢子，分生孢子萌发产生芽管能形成次生分生孢子。分生孢子目前被认为是稻曲病菌有效的侵染形态，稻曲病的分生孢子可以在水稻孕穗期幼颖的颖壳表面形 成菌丝并伸展到颖壳内部[代光辉等.稻曲病不同抗性水稻品种的组织化学及分生孢子侵染途径的初步观察.植物病理学报，2005，35 (I): 37-42]，在水稻孕穗期采用人工喷雾接种和注射接种方法证实了稻曲病菌的分生孢子能引起水稻发病并产生稻曲球病粒[王疏等.稻曲病接种菌源及接种方法的研究.辽宁农业科学，1996 (I):33-35;杨秀娟等.水稻稻曲病室内人工接种技术.植物保护学报，2011, 38(5):395-400]。前期研究发现，稻曲病菌分生孢子在含有枯草芽孢杆菌菌体的水琼脂培养基平板上不能正常萌发，表现为不萌发或已萌发产生的芽管短而干缩，说明在枯草芽孢杆菌菌体存在下，分生孢子萌发受抑制。在PSA培养基平板中，稻曲病菌菌落与枯草芽孢杆菌对峙生长4天后，在两者中间能产生宽度值约Ilmm的抑菌带，对峙生长20天后发现，稻曲病菌菌落形态萎缩，菌落边缘菌丝畸形膨大，原生质溢出，表明枯草芽孢杆菌产生的代谢物质也能抑制病菌菌丝的生长，并能杀死菌丝(附图1)。枯草芽孢杆菌是一类嗜温、好氧或兼性厌氧的腐生细菌，在自然界中分布广泛，极易分离培养，对人畜无害，不污染环境。能够产生对热、紫外线、电磁辐射有很强抗性的芽孢，耐受各种不良的环境条件。产生多种抗菌素(如抗真菌肽、脂肽抗生素、小分子的多糖物质、大分子的抗菌蛋白)和酶(如蛋白酶、淀粉酶、酯酶、几丁质酶及乙酰基氨基葡糖苷酶等细胞壁降解酶)，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。对植物多种病原菌(如香蕉枯萎病菌、小麦白粉病菌，稻瘟病菌、棉花立枯病菌、大豆根腐病菌、番茄灰霉病菌、辣椒炭疽病菌等)产生抑制，已经在黄瓜、辣椒、香蕉、水稻、小麦、玉米、棉花等农作物主要病害上表现出很好的防治效果。目前利用枯草芽孢杆菌及其菌剂生物防治水稻稻曲病的研究和应用较少，利用本专利技术的枯草芽孢杆菌及其代谢产物对稻曲病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用，开发稻曲病菌的生防微生物菌剂用于农业生产，对保障我国水稻粮食的安全生产和增产，减少因化学农药的大量投入使用产生的环境污染等问题起着重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种对水稻稻曲病菌具有较强抑制活性的枯草芽孢杆菌及其在稻曲病生物防治中的应用，利用本专利技术的枯草芽孢杆菌及其代谢产物对稻曲病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用，开发稻曲病菌的生防微生物菌剂用于农业生产，解决使用化学农药对人、畜、环境等的危害，保障我国水稻粮食的安全生产和增产，减少因化学农药的大量投入使用产生的环境污染等问题。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案: 1.本专利技术的枯草芽孢杆菌T122F菌株,其16s rDNA序列如SEQID NO:1 所示。2.本专利技术的枯草芽孢杆菌iBacillus subtilis)Tl22Y菌株，已经于2009年4月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，保藏编号为:CGMCC N0.3043。3.本专利技术的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) T122F菌株形态学鉴定:如下表I中所示: 表1细胞形态和生理生化试验结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌T122F菌株的保藏号为CGMCC?No.3043，其16s?rDNA序列如SEQ?ID?NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于:所述枯草芽孢杆菌T122F菌株的保藏号为CGMCCN0.3043，其 16s rDNA 序列如 SEQ ID NO:1 所示。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于:所述枯草芽孢杆菌T122F菌株从香蕉植株体内分离筛选获得。3.—种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌应用，其特征在于:所述枯草芽孢杆菌T122F菌株用于抑制水稻稻曲病菌的生长及其病害的防治。4.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的选育方法，其特征在于:选育方法为:切取健康香蕉植株假茎3-5g，用无菌水冲洗晾干后，用70% V/V酒精表面消毒20-40S后，再用0.1wt.%升萊表面消毒2-4min,无菌水冲洗3次后晾干；样品加10_15ml无菌水碾碎,静止15-20min，取50 μ L涂于KB培养基平板中，28°C黑暗培养48~72h，根据枯草芽孢杆菌的菌落形态、颜色等挑取单菌落，按常规方法用NA培养基进行菌株纯化和保存；菌株对稻曲病病原菌的生物测定采用平板对峙生长法，即在直径为9cm的PSA固体培养基平板中央接入直径为8mm的病原真菌菌块，同时在距菌块两侧2cm处用接种环点接一小环在28°C、NA培养基上培养24-26h的待测菌株菌落，接着28°C下黑暗培养6-8d，筛选获得对稻曲病菌生长具有明显抑制作用的枯草芽孢杆菌T122F。5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌的选育方法，其特征在于:所述的KB培养基配方为:蛋白胨 20.0g, MgSO4.7H20 1.5g，K2HPO4.H2O 1.8g，甘油 10.0ml，琼脂 16.0~18.0g,蒸馏水 1000.0ml, ρΗ7.0-7.2 ； 培养用的NA培养基配方为:蛋白胨5.0g，牛肉浸膏3.0g，葡萄糖2.5g，琼脂16.0~18.0g,蒸馏水 1000.0ml, pH 7.0-7.2 ；` 对峙培养用的PSA固体培养基配方为:马铃薯200.0g,蔗糖20.0g,琼脂20g，蒸馏水1000.0ml, pH 7.0-7.2。6.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于:所述枯草芽孢杆菌T122F菌株在抑制水稻稻曲病菌生长作用中的具体步骤为: (1)T122F菌株培养:将所述T122F菌株在37°C条件下用改良细菌发酵液体培养基振荡培养3天，培养液含菌量约为50-100亿活芽孢/mL，获得的发酵培养液4°C保存备用； (2)T122F无菌培养滤液制作:将所述T122F菌株在37°C条件下用改良细菌发酵液体培养基振荡培养3天,发酵液用无菌的双层滤纸过滤后,在1000Orpm条件下离心10-20min,取离心后的上清液，用0.22 μ m滤膜过滤除菌，得到无菌体上清液，4°C保存备用； (3)稻曲病菌的分离和培养:从水稻田中采集新鲜的黄色、黄绿色或绿色稻曲球，采用改良的厚垣孢子悬浮液法分离稻曲病菌；用无菌挑针刮取单粒稻曲球表面上的厚垣孢子粉，置于无菌培养皿中，加入0.5mL的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀娟，陈福如，甘林，石妞妞，阮宏椿，杜宜新，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：