本发明专利技术公开了一种老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，包括步骤：准备外植体、外植体消毒、初代诱导、诱导愈伤组织、生成不定芽、丛生芽增殖和壮苗、诱导具鳞茎试管苗、诱导试管鳞茎。本发明专利技术以冷藏芯芽为初始外植体，利用产生的中间繁殖体材料芽茎和鳞芽，分别经愈伤组织途径和器官发生途径获得丛生芽；可以通过愈伤组织和芽的循环增殖来提高老鸦瓣的繁殖系数；得到带根的基部膨大试管苗和试管鳞茎，有利于提高移栽成活率、提高耐贮藏、耐运输能力和缩短繁殖周期，且方法简单，成本较低，适宜于生产应用，对实现老鸦瓣的可持续利用具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于中药材栽培
，具体地说，本专利技术涉及一种。
技术介绍
老鸦瓣Tulipa edulis (Miq.)Baker.为百合科(Liliaceae)郁金香属(TulipaL.)药用植物，分布于江苏、安徽、浙江、江西、湖北、湖南、辽宁、山东和陕西等省，朝鲜和日本也有分布。其除去膜质皮及绒毛后的干燥鳞茎为中药材光慈菇。据本草考证，老鸦瓣历史上曾长期作为中药材山慈菇的主要基原植物。传统中医认为，光慈菇味甘、辛，性寒，有小毒，清热解毒，散结消肿，主治咽喉肿痛、瘰疬结核，瘀滞疼痛，痈疖肿毒，蛇虫咬伤。目前也是治疗多种肿瘤的常用药，如咽喉癌、淋巴瘤、乳腺癌等。野外观察发现老鸦瓣生长期短，地上茎叶生长时间IOOd左右。有性繁殖存在“花而不实”现象，种子自然萌发率低。无性繁殖通过母鳞茎鳞片上的腋芽、母鳞茎基部芽茎等进行，但母鳞茎存在更替现象，当年母鳞茎消失，导致繁殖系数偏低。目前光慈菇药材主要来源于野生，已满足不了市场需求，急需一种快速繁殖老鸦瓣的技术。
技术实现思路
基于此，本专利技术提供了一种。一种，包括以下步骤:(1)外植体准备7月底至8月上旬采集自然休眠的老鸦瓣鳞茎，冲洗，于0~2°C进行湿沙冷藏层积处理，3.5~4.5个月取出作为外植体；(2)外植体消毒取外植体，除去绒毛层，饱和洗衣粉溶液清洗后，剖取保留完整基部的芯芽，先用酒精，再用升汞浸泡消毒，无菌水冲洗，吸干表面水分，备用；(3)初代诱导将消毒后的外植体接种于初代诱导培养基中，1~2个月后形成鳞芽和芽茎；所述初代诱导培养基为:含蔗糖30g.L_\琼脂5-7g.\ρΗ5-6的MS培养基；所述初代诱导的培养条件为:光照1500-30001x，温度22±1°C，光照时间8_16h/d，湿度70%~80% ;(4)诱导愈伤组织、生成不定芽将芽茎切段接种于愈伤组织诱导培养基中培养，30~50天得到愈伤组织；将愈伤组织接种于继代增殖培养基中进行继代增殖；1~2个月后将增殖后的芽茎愈伤组织切块接种于不定芽分化培养基中培养2-3个月，完成不定芽、丛生芽分化，生成不定芽和丛生芽；所述愈伤组织诱导培养基为:含6-BA 0.5-1.0mg.L' NAA1.0-2.0mg.L'蔗糖30g.L—1、琼脂5-7g.L—1、pH5-6的MS培养基；所述愈伤组织继代增殖培养基为:含6-BA0.2-1.0mg.L'NAA 0.5-2.0mg.L'蔗糖 30g.L'琼脂 5_7g.L'pH5_7 的 MS 培养基；所述愈伤组织不定芽分化培养基为:含6-BA1.0-2.0mg-T1,NAA 0-0.5mg ?Ι/1、蔗糖30g琼脂5-7g.L-1、pH5-6的MS培养基；或者将鳞芽接入不定芽诱导培养基中，直接诱导生成不定芽；所述不定芽诱导培养基为:含 6-BA 0.5_2mg.L \ NAA 0.01-0.5mg.L、鹿糖 30g.L \琼脂 5_7g.L \ pH5-6的MS培养基；(5)增殖和壮苗将步骤(4)获得的不定芽中的细弱不定芽转入增殖培养基中增殖，得到再生不定芽，再转入壮苗培养基中壮苗得到生根的基部膨大的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；将步骤(4)获得的不定芽中的短壮不定芽直接转入壮苗培养基中进行壮苗，得到生根的基部膨大的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；所述不定芽增殖培养基为:含6-BA 0.2~1.0mg.L-1、NAA 0-0.2mg.L-1、蔗糖30g 琼脂5-7g.L'pHS-e的MS培养基；所述壮苗培养基为:含6-BA0-0.2mg.L'NAA0-0.2mg.L-1、蔗糖 30g.L-1、琼脂 5-7.L-1、pH5_6 的 MS 培养基；经壮苗后的不定芽或试管苗的根呈黄白色，含白色根毛，根数一般为6-10条；(6)诱导基部膨大呈鳞茎状的试管苗将步骤⑶中的鳞芽和芽茎接入含蔗糖30g.ΙΛ琼脂5_7g.?ΛρΗ5_6的MS培养基中培养，1.5~2.5个月后，芽茎顶端直接形成小鳞茎或芽茎顶端爆开形成粗壮试管苗，鳞芽直接形成试管苗；1.5~2.5个月后形成基部膨大呈鳞茎状的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；(7)诱导试管鳞茎将步骤(4)中增殖得到的丛生芽于3_6°C暗处理1-3个月后，转入含30_90g.L_1鹿糖的无激素MS培养基中，于22-24°C、光照8-16h/d培养2_3个月，得到膨大、成熟的试管鳞茎，即为老鸦瓣无性快繁体系。以上经步骤(1)-(7)获得的生根的基部膨大的试管苗、基部膨大呈鳞茎状的试管苗和典型膨大、成熟的试管鳞茎的方法即为老鸦瓣无性快繁体系的建立过程。在其中一个实施例中，步骤(1)中，所述湿沙冷藏层积处理为:将鳞茎与灭过菌的河沙以1: 2-4的体积比混匀后放入不完全密封的自封袋中，所述河沙的含水量为6wt %~8wt%。自封袋不密闭，使鳞茎能透气。河沙的含水量保持在6wt%~8wt%的范围，此时，河沙用手攥就成团，手松开沙团就裂开。在其中一个实施例中，步骤(3)中，所述初代诱导培养基为:含蔗糖30g 琼脂6.5g.L' ρΗ5.8 的 MS 培养基。在其中一个实施例中，步骤⑷中，所述愈伤组织诱导培养基为:含6-BA0.5mg.I71、NAA 2.0mg.L'鹿糖 30g.I71、琼月旨 6.5g.L' pH5.8 的 MS 培养基；所述愈伤组织继代增殖培养基为:含6-BA 0.5mg.L' NAA 2.0mg.L_\蔗糖30g.L_\琼脂6.5g.L' pH5.8的MS培养基；所述愈伤组织不定芽分化培养基为:含6-BA 2mg.L' NAA0.2mg.L'蔗糖30g.L'琼脂6.5g.L' pH5.8的MS培养基；所述鳞芽不定芽诱导培养基为:含 6-BA Img.I71、NAA 0.01mg.L'鹿糖 30g.I71、琼月旨 6.5g.I71、pH5.8 的 MS 培养基。在其中一个实施例中，所述步骤(4)中用于诱导愈伤组织的芽茎为短缩芽茎的芽茎顶端，用于增殖的愈伤组织为愈伤组织类型II。在其中一个实施例中，步骤(5)中，所述不定芽增殖培养基为:含6-BA 0.2~0.5mg.L' NAA 0.2mg.L'蔗糖 30g.L'琼脂 6.5g.L' pH5.8 的 MS 培养基；所述壮苗培养基为:含 6-BA Omg.L'NAA 0.2mg.L'鹿糖 30g.I71、琼月旨 6.5g.L'pH5.8 的 MS 培养基。在其中一个实施例中，步骤(6)中所述培养基为含蔗糖30g.L'琼脂6.5g.L'pH5.8的MS培养基。在其中一个实施例中，步骤(7)中所述试管鳞茎诱导的处理方法为:将步骤(4)中增殖得到的丛生芽于5°C暗处理2-3个月后，转入含60g.L-1蔗糖的无激素MS培养基中，于23°C、光照16h/d培养2-3个月，得到膨大、成熟的试管鳞茎。本专利技术通过快速筛选不同外植体、培养基激素配比和多种诱导途径，建立老鸦瓣无性快繁体系，使冷藏后的老鸦瓣芯芽外植体在约30-40d诱导出芽茎，芽茎经约20-40d诱导出愈伤组织，愈伤组织约1-2个月分化出丛生芽；丛生芽在2-3个月内通过增殖和壮苗得到基部膨大的试管苗；增殖后的丛生芽低温处理2-3个月后，转无激素培养基培养2-3个月形成典型、成熟试管鳞茎。也可通过冷藏芯芽形成的芽茎本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体准备采集自然休眠的老鸦瓣鳞茎，冲洗消毒，于0～2℃进行湿沙冷藏层积处理，3.5～4.5个月取出作为外植体；(2)外植体消毒除去外植体绒毛层，饱和洗衣粉溶液清洗后，剖取保留完整基部的芯芽，先用酒精，再用升汞浸泡消毒，无菌水冲洗，吸干表面水分；(3)初代诱导将消毒后的外植体接种于初代诱导培养基中培养，1～2个月后形成鳞芽和芽茎；所述初代诱导培养基为：含蔗糖30g·L?1、琼脂5?7g·L?1、pH5?6的MS培养基；所述初代诱导的培养条件为：光照1500?3000lx，温度22±1℃，光照时间8?16h/d，湿度70％～80％；(4)诱导愈伤组织、生成不定芽将芽茎切段接种于愈伤组织诱导培养基中培养，30～50天得到愈伤组织；将愈伤组织接种于继代增殖培养基中进行继代增殖；1～2个月后将增殖后的芽茎愈伤组织切块接种于不定芽分化培养基中培养2?3个月，完成不定芽、丛生芽分化，生成不定芽和丛生芽；所述愈伤组织诱导培养基为：含6?BA?0.5?1.0mg·L?1、NAA1.0?2.0mg·L?1、蔗糖30g·L?1、琼脂5?7g·L?1、pH5?6的MS培养基；所述愈伤组织继代增殖培养基为：含6?BA?0.2?1.0mg·L?1、NAA?0.5?2.0mg·L?1、蔗糖30g·L?1、琼脂5?7g·L?1、pH5?7的MS培养基；所述愈伤组织不定芽分化培养基为：含6?BA1.0?2.0mg·L?1、NAA?0?0.5mg·L?1、蔗糖30g·L?1、琼脂5?7g·L?1、pH5?6的MS培养基；或者将鳞芽接入不定芽诱导培养基中，直接诱导生成不定芽；所述不定芽 诱导培养基为：含6?BA?0.5?2.0mg·L?1、NAA?0.01?0.5mg·L?1、蔗糖30g·L?1、琼脂5?7g·L?1、pH5?6的MS培养基；(5)增殖和壮苗将步骤(4)获得的不定芽中的细弱不定芽转入增殖培养基中增殖，得到再生不定芽，再转入壮苗培养基中壮苗得到生根的基部膨大的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；将步骤(4)获得的不定芽中的短壮不定芽直接转入壮苗培养基中进行壮苗，得到生根的基部膨大的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；所述不定芽增殖培养基为：含6?BA?0.2～1.0mg·L?1、NAA?0?0.2mg·L?1、蔗糖30g·L?1、琼脂5?7g·L?1、pH5?6的MS培养基；所述壮苗培养基为：含6?BA0?0.2mg·L?1、NAA?0?0.2mg·L?1、蔗糖30g·L?1、琼脂5?7·L?1、pH5?6的MS培养基；(6)诱导基部膨大呈鳞茎状的试管苗将步骤(3)中的鳞芽和芽茎接入含蔗糖30g·L?1、琼脂5?7g·L?1、pH5?6的MS培养基中培养，1.5～2.5个月后，芽茎顶端直接形成小鳞茎或芽茎顶端爆开形成粗壮试管苗，鳞芽直接形成试管苗；1.5～2.5个月后形成基部膨大呈鳞茎状的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系；(7)诱导试管鳞茎将步骤(4)中增殖得到的丛生芽于3?6℃暗处理1?3个月后，转入含30?90g·L?1蔗糖的无激素MS培养基中，于温度22?24℃、光照8?16h/d条件培养2?3个月，得到膨大、成熟的试管鳞茎，即为老鸦瓣无性快繁体系。...
【技术特征摘要】
1.一种老鸦瓣无性快繁体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)外植体准备 采集自然休眠的老鸦瓣鳞茎，冲洗消毒，于O~2°C进行湿沙冷藏层积处理，3.5~4.5个月取出作为外植体； (2)外植体消毒 除去外植体绒毛层，饱和洗衣粉溶液清洗后，剖取保留完整基部的芯芽，先用酒精，再用升汞浸泡消毒，无菌水冲洗，吸干表面水分； (3)初代诱导 将消毒后的外植体接种于初代诱导培养基中培养，I~2个月后形成鳞芽和芽茎；所述初代诱导培养基为:含蔗糖30g.L_\琼脂5-7g·L-1、ρΗ5-6的MS培养基；所述初代诱导的培养条件为:光照1500-30001x，温度22±1°C，光照时间8_16h/d，湿度70%~80% ; (4)诱导愈伤组织、生成不定芽 将芽茎切段接种于愈伤组织诱导培养基中培养，30~50天得到愈伤组织；将愈伤组织接种于继代增殖培养基中进行继代增殖；1~2个月后将增殖后的芽茎愈伤组织切块接种于不定芽分化培养基中培养2-3个月，完成不定芽、丛生芽分化，生成不定芽和丛生芽；所述愈伤组织诱导培养基为:含6-BA 0.5-1.0mg·L-1,NAA1.0-2.0mg.L-1、蔗糖30g 琼脂5-7g.·L-1、ρΗ5-6的MS培养基；所述愈伤组织继代增殖培养基为:含6-BA 0.2-1.0mg.L—1、NAA 0.5-2.0mg.L-1、蔗糖30g.L-1、琼脂5_7g·L-1、ρΗ5_7的MS培养基；所述愈伤组织不定芽分化培养基为:含 6-ΒΑ1.0-2.0mg·L-1NAA 0-0.5mg·L-1、蔗糖 30g·L-1琼脂 5_7g·L-1、PH5-6的MS培养基； 或者将鳞芽接入不定芽诱导培养基中，直接诱导生成不定芽；所述不定芽诱导培养基为:含 6-BA 0.5-2.0mg·L-1、 NAA 0.01-0.5mg·L-1、鹿糖 30g·L-1、琼脂 5_7g·L-1、 pH5-6 的MS培养基； (5)增殖和壮苗 将步骤(4)获得的不定芽中的细弱不定芽转入增殖培养基中增殖，得到再生不定芽，再转入壮苗培养基中壮苗得到生根的基部膨大的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系； 将步骤(4)获得的不定芽中的短壮不定芽直接转入壮苗培养基中进行壮苗，得到生根的基部膨大的试管苗，即为老鸦瓣无性快繁体系； 所述不定芽增殖培养基为:含6-BA 0.2~1.0mg·L-1、NAA 0-0.2mg·L-1蔗糖30g 琼脂5-7g·L-1、pHS-e的MS培养基；所述壮苗培养基为:含6-BA0-0.2mg·L-1、NAAo-0.2mg.L-1、蔗糖 30g.L-1、琼脂 5-7.L-1、pH5_6 的 MS 培养基； (6)诱导基部膨大呈鳞茎状的试管苗 将步骤(3)中的鳞芽和芽茎接入含蔗糖30g.L—1、琼脂5-7g.L—1、pH5-6的MS培养基中培养，1.5~2.5个月后，芽茎顶端直接形成小鳞茎或芽茎顶端...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭巧生，徐红建，马宏亮，朱再标，赵桂华，邹琦，苏碧茹，邓慧敏，赖晓明，
申请(专利权)人：广州白云山中一药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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