一种基于炎症反应的抗动脉粥样硬化药效评价方法，其特征在于，经过以下步骤：步骤1，将平滑肌细胞以种植于Millicell@insert的PE膜外侧，8h待细胞贴壁后翻转；步骤2，在膜的内侧面种植内皮细胞，共培养6天；步骤3，接种单核细胞THP-1，加入oxLDL，IL-1及受试药物，培养24小时。步骤4，检测以下项目中的任何一项：检测内皮细胞中的MCP-1，TNFα的含量；单核细胞表面CD36的含量；平滑肌细胞中的MDA，MMP2的含量，观察平滑肌细胞骨架的变化；观察内皮细胞ICAM-1的表达。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】，其特征在于，经过以下步骤：步骤1，将平滑肌细胞以种植于Millicell@insert的PE膜外侧，8h待细胞贴壁后翻转；步骤2，在膜的内侧面种植内皮细胞，共培养6天；步骤3，接种单核细胞THP-1，加入oxLDL，IL-1及受试药物，培养24小时。步骤4，检测以下项目中的任何一项：检测内皮细胞中的MCP-1，TNFα的含量；单核细胞表面CD36的含量；平滑肌细胞中的MDA，MMP2的含量，观察平滑肌细胞骨架的变化；观察内皮细胞ICAM-1的表达。【专利说明】
:本专利技术涉及一种药物的药效评价方法，特别涉及。
技术介绍
:关于动脉粥样硬化(AS)的发病机制曾有以下几种学说:脂质浸润学说、血小板聚集和血栓形成学说、单克隆平滑肌细胞增生学说及免疫学说和损伤反应学说，其中损伤反应学说和由此发展而来的炎症理论，较为全面地解释了 AS的形成发展过程。目前认为，AS从发生发展到转归的全过程就是一个慢性的炎症过程，众多炎症细胞和炎症介质参与其中，但炎症参与AS过程的作用机制至今尚未完全阐明，目前研究主要集中于各种炎症细胞、炎症介质的作用及相互关系方面。AS病灶内存在内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、平滑肌细胞和肥大细胞等主要细胞，目前研究较多且与AS发生和发展关系较为密切的炎症细胞是单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞。在AS发病过程中，补体系统的参与也促进了炎症反应。现已在AS病灶中发现了 Cl?9等补体固有成分以及多种补体活化片段，尤其是补体活化终末攻膜复合物C5b9(MAC)存在于所有增厚的动脉内膜及纤维斑块中。CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着于细胞膜表面的补体调节蛋白，其在调节MAC装组中发挥着关键作用。最近研究表明，较对照组相比⑶59与ApoE基因共敲除小鼠发生AS的进程加速，而此效应在内皮细胞过度表达⑶59时被削弱，研究者证实MAC有促AS作用，而⑶59则抑制AS，提示抑制MAC形成可能是一种抗AS疗法。随着研究的深入，已发现越来越多的炎症介质参与了 AS的发生与发展。各种炎症细胞通过相关的细胞因子、黏附分子等炎症介质相互关联、相互作用，从而构成了复杂的网络，它们级联放大了炎症反应，共同促进了 AS的进展。如:C反应蛋白(CRP)，黏附分子，MCP-1，IL-6，TNF-a，salusins，除上述炎症介质以外，目前已经发现与AS关系较密切炎症介质还有 IL-2、IL-4、IL-10、IL-18、IFN1、TGF-β 等等。AS从起始发病到出现临床心血管事件的整个过程中，炎症反应都发挥着重要的作用，然而目前人们对于这个复杂网络的众多环节所起的具体作用及其机制还知之甚少。此夕卜，虽然在一些AS动物模型中，针对炎症多个环节的抗炎治疗都取得一定的疗效，但临床上尚缺乏系统的大规|旲的实验研究。炎症反应在动脉粥样硬化(AS)形成、发展的各个阶段普遍存在。单核细胞(MC)、内皮细胞(EC)、平滑肌细胞(SMC)之间的相互作用及触发的后继效应是AS炎症反应的核心环节。本专利技术根据上述细胞之间的相互作用关系，开发了一种药物筛选模型，以期通过一种简单实用的方法对抗动脉粥样硬化的药物进行药效筛选，该方法用体外培养细胞的方法，可以大规模的进行药物初筛，给新药研发提供一种新的有效的筛选方法。本专利技术针对AS形成及炎症反应过程中复杂的细胞间相互关系，以MillicellOinsert为载体，采用EC-SMC-MC共培养的方法，观察在AS危险因子oxLDL和IL-1 β刺激下三种细胞的相互作用及其功能的特征性改变，以此构建AS治疗药物药效研究的新的方法和评价体系，为从炎症角度干预AS的药物研究提供有效工具。
技术实现思路
:本专利技术是，所述方法采用oxLDL和IL-1作为刺激因子，作用于内皮细胞-平滑肌细胞-单核细胞(EC-SMC-MC)共培养体系中，具有明显动脉粥样硬化炎性反应特征。本专利技术所述的方法，实际操作需要经过以下步骤:步骤I，将平滑肌细胞以种植于MiIlicelIOinsert的PE膜外侧，8h待细胞贴壁后翻转；步骤2，在膜的内侧面种植内皮细胞，共培养6天；步骤3，接种单核细胞THP-1，加入oxLDL, IL-1及受试药物，培养24小时。步骤4，检测以下项目中的任何一项:检测内皮细胞中的MCP-1，TNFa的含量；单核细胞表面CD36的含量；平滑肌细胞中的MDA，MMP2的含量，观察平滑肌细胞骨架的变化；观察内皮细胞ICAM-1的表达。所述步骤I，方法如下:将平滑肌细胞种植于MiIlicelIOinsert的PE膜外侧，8h后翻转。所述步骤2，方法如下:翻转后在MillicellOinsert的PE膜的内侧种植内皮细胞,共培养6天。所述步骤3，方法如下:以IX 105/cm2接种单核细胞THP-1，加入oxLDL, IL-1 β及受试药物，培养24h。所述步骤4，其中，检测内皮细胞中的MCP-1，TNFa的含量方法如下:吸取MillicellOinsert内培养基，反复3次，然后吸尽上清，离心，取上清，检测EC层 MCP-1，TNFa ；检测单核细胞表面⑶36的含量方法如下:离心后得到的沉淀为单核THP-1细胞沉淀，重悬于Iml PBS,流式细胞仪检测单核细胞表面⑶36 ；检测平滑肌细胞中的MDA，MMP2的含量方法如下:吸取下层培养板内培养基，离心，取上清，检测MDA，MMP2含量;Millicell@insert膜免疫荧光染色取材方法如下:取出MilliCell@inSert，PBS清洗insert内侧膜、外侧膜各3次，用手术刀片将膜沿insert边缘轻轻切下,每组2个insert内侧膜朝上，2个insert外侧膜朝上，粘片剂将膜固定在载玻片上。观察内皮细胞ICAM-1的表达方法如下:Insert内侧膜即EC层细胞滴加PBS50 μ I洗I次，吸尽PBS后，滴加PE-1CAM-1抗体10 μ I，培养箱中闭光孵育30min后，PBS清洗2遍，激光共聚焦显微镜575nm检测ICAM-1表达。观察平滑肌细胞骨架的变化方法如下:Insert外侧膜即平滑肌细胞层用3.7%多聚甲醒固定IOmin,丙酮脱水Imin,0.2%TritonX100室温下渗透lOmin，再用PBS轻洗两遍，滴加10 μ g/ml FITC-鬼笔环肽20 μ 1，培养箱中闭光孵育30min，PBS清洗2遍，激光共聚焦显微镜488nm观察细胞骨架的变化；本专利技术中，模型建立方法属创新方法，各个指标的检测方法均属于现有技术范畴，可以采用文献报道的方法进行检测，在该创新模型中各指标的检测结果可以判断药物的有效性。本专利技术所述方法，其中有关名称术语的解释如下:血管平滑肌细胞:血管平滑肌(vascular smooth muscle)是指存在于血管壁且组成其主要部分的特定类型平滑肌。构成平滑肌的细胞称为血管平滑肌细胞。HASMC:人类胳动脉平滑肌细胞(Human Aortic Smooth Muscle Cells)。种植:将细胞悬液接种在培养介质表面的过程。Millicelliinsert 的 PE 膜外侧:MiIlicelIOinsert 是一个共培养小室的品牌，PE膜是共培养小室底层接种细胞的膜的材料名称。共培养小室是一个悬空站立本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于炎症反应的抗动脉粥样硬化药效评价方法，其特征在于所述方法包括，采用oxLDL和IL?1作为刺激因子，作用于内皮细胞?平滑肌细胞?单核细胞（EC?SMC?MC）共培养体系，用所述方法建立的药效评价模型具有明显动脉粥样硬化炎性反应特征。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱晓新，李玉洁，杨庆，翁小刚，陈颖，王娅杰，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：
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