一种用于猪病诊断的三重连接探针扩增检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒的靶核酸的探针和引物，三重同步核酸定性检测试剂，三重连接探针扩增检测方法。本发明专利技术针对三种病毒核酸的特异性探针杂交后的连接产物进行PCR扩增，能够同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒等三种混合感染的常见病原，这种多重验证结点集成一体化设计极大提高了检测结果的特异性与可靠性，本发明专利技术对原有的多重连接探针扩增检测技术的关键参数进行了调整，使检测效率显著提高的同时也降低了检测成本。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒的靶核酸的探针和引物，三重同步核酸定性检测试剂，三重连接探针扩增检测方法。本专利技术针对三种病毒核酸的特异性探针杂交后的连接产物进行PCR扩增，能够同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒等三种混合感染的常见病原，这种多重验证结点集成一体化设计极大提高了检测结果的特异性与可靠性，本专利技术对原有的多重连接探针扩增检测技术的关键参数进行了调整，使检测效率显著提高的同时也降低了检测成本。【专利说明】
本专利技术涉及生物核酸分子检测
，特别涉及一种新技术的新领域应用，SP猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒核酸同步多重连接扩增技术检测方法。
技术介绍
动物检验检疫问题成为了近些年国际社会关注的热点问题,我国加入WTO已逾十年，考虑到技术性贸易壁垒问题与输入性传染病风险问题，每年我国对大量进出口畜牧产品的卫生质量要求越来越高,要求检测项目也越来越多，如各种致病性病原体以及人兽共患病病原体等。同时为了确保食品卫生安全、保护国民健康安全，必须加强在源头上对畜产品进行安全性检测。目前应用于猪患病毒性传染病的检测方法有以下几种:聚合酶链式反应(PCR)、病毒分离培养鉴定法、电镜观察、酶联免疫吸附试验、免疫荧光试验等。现实中临床上发病猪往往以多种病毒混合感染为主，上述方法检测通量低成本高，操作不便，不利于同时多批量多重感染病原体的检测。多重连接扩增技术(multiplexligation-dependent probe amplification,MLPA)由荷兰的Dr.Schouten JP于2002年专利技术，最初仅应用于医学检测目的，目前MLPA技术已应用于多种领域的研究及基因诊断，如单核苷酸多态性(SNP)和基因突变检测、染色体数目异常、遗传疾病基因缺失重复、基因甲基化检测、抑癌基因诊断及mRNA分析等。由于MLPA操作简便、成本低廉、应用领域广，这几年来，已有超过上百篇的研究报告发表，但是在动物疫病检测领域的应用尚无报道。MLPA是将核酸的杂交检测和PCR链式扩增相结合，从而实现靶分子的高效特异性分析。其核心的技术是合成序列特异的长探针和短探针。短探针由两段核苷酸组成，一段是PCR扩增的通用引物，一段是病毒序列特异的探针。长探针由三段核苷酸组成，除了 PCR扩增的通用引物互补序列和病毒特异性序列外，在两者之间还加入特定大小的填充序列(指纹序列)。当MLPA的两种探针结合到彼此相邻的靶序列上的时候，在连接反应时，长探针就和短探针发生连接，生成一条两端分别含有上下游通用引物的全长探针，并在通用引物的扩增之下，使模板成链式放大，实现靶分子的高灵敏度检测，其检测极限可达3000-6000个靶分子拷贝。MLPA并不是扩增病毒特异的靶序列，而是扩增与病毒靶序列结合的探针，换句话说，首先是给每种病毒特异的探针加入特定大小的指纹序列，然后通过通用引物将不同的“指纹”扩增表现出来，最后通过对“指纹”的分析，实现多种核酸的检测，同时序列特异的两段探针确保了每种病原的指纹具有高度的特异性。MLPA利用核酸杂交、连接反应和PCR扩增反应，可以在同一试管内检测多达45种不同核酸序列拷贝数变化。该技术主要包括:探针与靶序列的杂交、探针的特异化连接、连接探针的扩增和结果的检测分析。针对每一个待测靶基因序列，均有一对MLPA探针，其一般由一个短的寡核苷酸片段(短探针)和一个长的寡核苷酸片段(长探针)组成。该技术的特色之一是仅扩增连接完好的探针，而不是扩增样本靶序列。该技术的扩增环节仅需两条引物，即通用引物UPl和UP2。在所有短探针的5’端均有一段共同序列，该序列与引物UPl的核酸序列相同；在所有长探针的3’端均有一段共同序列，该序列与引物UP2的核酸序列互补。可见，所有连接探针的PCR扩增用的是同一对引物。若两探针连接，则扩增可进行；而若两探针未连接，则扩增无法进行。各长探针在共同序列和与靶序列互补的序列间有不同长度的填充片段，该片段长度不同使连接后的MLPA探针长度不同，故其扩增片段长度亦不同。一般相临两产物的长度相差6~8bp，因此可同时检测基因组的多种不同靶基因。扩增后进行结果检测分析比对，得出结论。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能同步检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒核酸的高特异性检测方法。所述的多重同步核酸定性检测方法的探针为选自以下病毒的特征片段:猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病毒(PRV)0本专利技术能够同时检测三种常见猪混感病毒包括两种RNA病毒和一种DNA病毒，特异性极高。本专利技术的一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒的靶核酸的探针和引物，包括如下的序列组:I)针对猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因的探针左翼探针Probel05L:5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTGGCGCTACTCTTGTACCAGATA 3’右翼探针Probel05R:5’TACCAACTTCCTTCTGGACACTGTGCCAGCAAGATCCAATCTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3’2)针对猪瘟病毒E2基因的探针左翼探针Probel25L:5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACA 3’右翼探针Probel25R:5’ GCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTGC CAGCAAGATCCAATCTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3，3)针对猪伪狂犬病毒TK基因的探针左翼探针Probel50L:5’TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGCCAGCAAGATCCAATCTCCTGCGCAACGTCTACGCCAT 3’右翼探针Probel50R:5’ GCTGGTCAACACGTCGCGCTACCTGAGGTGCCAGCAAGATCCAAT CTGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3，4)通用引物正向引物UPl:5' TGGTTCGCTTAGGGTTGGTT 3'反向引物UP2:5' GTGGTATTGGATCGTGCAGAGA 3'所述右翼探针的5’端经过磷酸化修饰。所述5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTT与通用的正向引物UPl序列相同；所述TCTCTGCACGATCCAATACCAC 3’与通用的反向引物UP2序列反向互补。本专利技术的一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒的三重同步核酸定性检测试剂，包括MLPA杂交液、MLPA连接液、PCR反应液、RNA/DNA共提液、RT反应液、阳性对照品、阴性对照品、探针混合液、通用引物混合液、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC处理水；MLPA 杂交液包括 SALSA MLPA buffer ；MLPA 连接液包括 Ligase_65buffer A, Ligase_65buffer B, Ligase-65 连接酶；PCR 反应液包括 2 X Taq Master Mix ；R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及猪伪狂犬病毒的靶核酸的探针和引物，其特征在于，包括如下的序列组：?1）针对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的探针?左翼探针Probe105L：5’TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTGGCGCTACTCTTGTACCAGATA?3’?右翼探针Probe105R：5’TACCAACTTCCTTCTGGACACTGTGCCAGCAAGATCCAATCTC?TCTGCACGATCCAATACCAC?3’?2）针对猪瘟病毒E2基因的探针?左翼探针Probe125L：5’TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACA?3’?右翼探针Probe125R：5’GCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTGC?CAGCAAGATCCAATCTCTCTGCACGATCCAATACCAC?3’?3）针对猪伪狂犬病毒TK基因的探针?左翼探针Probe150L：5’TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGCCAGCAAGATCCAATCTCCTG?CGCAACGTCTACGCCAT?3’?右翼探针Probe150R：5’GCTGGTCAACACGTCGCGCTACCTGAGGTGCCAGCAAGATCCAAT?CTGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTCTCTGCACGATCCAATACCAC?3’?4）通用引物?正向引物UP1：5′TGGTTCGCTTAGGGTTGGTT?3′?反向引物UP2：5′GTGGTATTGGATCGTGCAGAGA?3′。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高慎阳，周铁忠，查恩辉，董筱萍，迟阳，
申请(专利权)人：辽宁医学院，
类型：发明
国别省市：