用于人乳头瘤病毒18基因检测的生物试剂制造技术

本发明专利技术提供了用于人乳头瘤病毒18（HPV18）基因检测的生物试剂盒、其制备方法以及在基因检测方面的应用。本发明专利技术的技术方案涉及引物和探针的设计、合成和纯化以及细胞提取液的配置和标准品的制备。所述试剂盒的组分包括：DNA提取液，HPV18PCR反应液，HPV18强阳性质控品和阴性质控品。采用本发明专利技术的试剂盒可通过PCR基因扩增的方法进行HPV18基因检测，实现对HPV18的筛查和临床诊断。本发明专利技术的试剂盒用于基因检测的步骤简便、检测效率高、结果可靠。

Biological reagent for detecting human papilloma virus 18 gene

The present invention provides a biological reagent kit for detecting human papillomavirus 18 (HPV18) gene, a method for preparing the same, and an application thereof in gene testing. The technical proposal of the invention relates to the design, synthesis and purification of primers and probes, and the configuration of cell extract and the preparation of standard products. The kit comprises DNA extraction solution, HPV18PCR reaction liquid, HPV18 strong positive control quality product and negative quality control product. The reagent box of the invention can detect the HPV18 gene through the method of PCR gene amplification, and realize the screening and the clinical diagnosis of the HPV18. The reagent kit of the invention has the advantages of simple and convenient steps, high detection efficiency and reliable result for gene detection.

【技术实现步骤摘要】
用于人乳头瘤病毒18基因检测的生物试剂
本专利技术涉及分子生物学领域的基因检测技术，尤其涉及用于人乳头瘤病毒18(HPV18)基因检测的生物试剂、其制备方法以及基因的检测方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是一种最小的DNA (脱氧核糖核酸)病毒。HPV呈球形，直径约为45~55nm，具有嗜上皮性，在人和动物中分布广泛。HPV在自然界中广泛存在，人类感染HPV十分普遍，感染率也很高。综合国外一些报道，在自然人群中HPV感染率从低于I %到高达50 %，在性活跃人群中20 %~80 %以上的人有HPV感染史。 HPV病毒在临床上可分为许多的亚型，而不同亚型的病毒可能导致不同的疾病。另外，根据致病力的程度或危险性大小，可将不同的亚型分为低危和高危两大类，其中HPV高危亚型的感染会引起生殖器癌和子宫颈癌上皮细胞病变。人乳头瘤病毒18 (HPV18)属于高危亚型，是宫颈癌的重要致病因素。目前宫颈癌的筛查主要是基于细胞学的检测方法，有宫颈巴氏(Pap)涂片、阴道镜活检、液基薄层细胞学或薄片制备细胞学检查(TCT)等多种。宫颈巴氏涂片是群体筛查的常规手段，但受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，准确性低，假阳性率高，重复性差，敏感性也有限，漏诊率可达30%。TCT法会引起不适、操作不便、费用高，不易为广大患者接受。宫颈组织活检有创伤，不利于人群普查。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有特异性强、灵敏度高的检测试剂盒，用于快速检测人乳头瘤病毒18(HPV18)类型。HPV18检测简单易行，标本可由医生采集或患者自取，是对细胞学检测方法的重要补充。为实现上述目的，本专利技术提供了一种用于人乳头瘤病毒18型(HPV18)基因检测的生物试剂、其制备方法以及在基因检测的方法。一方面，本专利技术提供了一种用于HPV18基因检测的试剂盒。所述试剂盒的组分包括:引物、探针、Taq聚合酶、IOXbuffer缓冲液、dNTP、试验标准品、阴性质控品和超纯水。其中，合成的引物是由包括CPG、四氮唑、乙酸酐和1-甲基咪唑、碘、dNTP的原料合成。根据HPV的不同分型设计不同引物和探针。另一方面，本专利技术还提供了用于HPV18基因检测的试剂盒的制备方法，其包括下述步骤:I)确定待测基因片段:根据科技文献的方向性报道初步选定候选基因片断，然后经研发过程中与待检样本病理相关性的比较，最终确认与临床疾病最具相关性的待测基因片断；2)根据所述待测基因片段设计并生产引物和探针，采用多核苷酸合成仪生产所述引物；3)提取细胞基因组DNA:用DNA提取液提取病人基因组及对照组基因组DNA ；4)确定PCR扩增条件，其包括酶、探针、引物、基因组DNA用量及PCR的扩增条件:不同组合的引物片断，根据实验结果的特异性，敏感性等技术特征，反复试验，同时进行多条所述待测基因片断的检测反应，最终确定包括所述引物、探针最佳浓度及酶的最佳反应条件，其中，PCR基因扩增的结果由荧光PCR仪来检测； 5)进行重复性检测以进一步确定反应条件:通过大量实验，反复比较实验结果中包括清晰度和灵敏性的因素，最终确定反应条件；6)根据最终确定的所述反应条件，制备试剂盒，其组分包括:引物、探针、dNTP、IOXbuffer缓冲液、Taq聚合酶、试验标准品、阴性质控品和超纯水。又一方面，本专利技术还提供了采用本专利技术试剂盒进行HPV18基因检测的方法。采用本专利技术的试剂盒进行HPV18基因检测，其中所述试剂盒的组分包括:细胞提取液、引物、探针、dNTPUOXbuffer缓冲液、Taq聚合酶、试验标准品、阴性质控品和超纯水。本专利技术以用基因组提取试剂盒提取的患者的细胞基因组DNA为模板，用试剂盒提供的引物、探针、dNTP、酶、试剂标准品等组分，20 μ L反应体系，按照特定的比例分别加入，采用PCR基因扩增技术，实现对HPV的基因检测。具体检测步骤如下:I)试剂准备:取PCR反应液备用。2)加样:向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品(包括标本和阳性质控品)上清液I μ 1,8，OOOrpm离心数秒，放入仪器样品槽。3)程序编辑:按对应顺序设置阴性质控品、以及未知标本(含阳性质控品)，并在样本参数中设置样品名称。设置程序后运行。本专利技术的技术关键涉及引物和探针的设计、合成和纯化以及细胞提取液的配置和标准品的制备。本专利技术优点是采用PCR基因扩增的方法检测基因分型，方法设计和流程比较简单；医院的投入比较少，一般医院的设备就可以检测；使用方便，无需特殊仪器和酶切步骤；检测耗时较短；检测效率高，结果可靠、有效，可用于HPV的筛查和临床诊断，具有相当大的市场潜力。基因扩增是所有DNA分析技术中最灵活和灵敏的手段，本专利技术以PCR为基础的检测方法是进行HPV DNA检测及分型的最好方法。本专利技术的试剂盒及其方法可以应用于检测、病毒负荷定量、DNA测序和突变分析，也可以进行多重扩增，同时分析多个DNA序列。【附图说明】有关本专利技术的上述简要介绍以及下述的详细描述，结合附图会得到更好的理解。图1描述用试剂盒提取b，c，d三个临床样本的基因组。图中:a表示HPV18阳性对照组，b，c，d分别为三个感染HPV患者的临床样本基因组，e表示阴性对照组。采用HPV18引物18F1，18R1和探针18P1进行PCR，FAM荧光信号检测；结果如图1所示，a显示为标准S型曲线、b，c，d样本曲线也为S曲线，e显示为直线。因此确定b，c，d患者感染HPV为18亚型。【具体实施方式】在对本专利技术作进一步描述之前，应当理解本专利技术并不局限于下述有关专利技术的【具体实施方式】。同时也应当理解，本文所使用的术语只是用于针对特定的实施方式进行描述，而不是用来进行限制。所用DNA合成仪为德国polygen，引物的制备方法是采用固相亚磷酰胺三酯法，亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3’端向5’端合成的，相邻的核苷酸通过3’ 一5’磷酸二酯键连接。检测中所需要的仪器设备主要有:DNA合成仪，荧光PCR仪等。本试剂盒检测分析的原理是:按照HPV病毒镶嵌在人体基因组中，而正常人中没有，因此，当以两种人的基因组为模板进行聚合酶链式反应的扩增时，病人出现病毒的目的条带即S曲线，而正常人不出现条带即无S曲线。用此种方法来检测宫颈癌病人。实施例1.引物的制备本例中引物的制备包括以下步骤:用德国polygenDNA合成仪合成引物和探针I)打开仪器和软件2)校准试剂选择滑块和校准10个柱子的滑块3)开启自动冲洗功能将液体充满各个管子。4)用CPG填充柱子滑 块中的孔在合成以前，应将柱子滑块里填充正确的CPG，柱子中填充好的CPG含有对应的3’端的核苷酸，因为仪器合成寡核苷酸的顺序是从3’端到5’端完成的。注意:加CPG过程中不能突然触击滤膜，否则可能会有泄漏出现。5)将滑块装到仪器上。6)合成开始前，输入所需要的序列作为主程序，按开始键开始运行。7)运行完后，将滑块从设备中卸下来，用戳子的细头端将柱子里的材料和滤膜去除掉。操作人员将柱子滑块附到模型台架上，并安装稳固。用小收本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于人乳头瘤病毒18（HPV18）基因检测的试剂盒，其包括DNA提取液，HPV18PCR反应液，HPV18强阳性质控品和阴性质控品，其中：所述HPV18PCR反应液包括超纯水，缓冲液，dNTP，引物18F1和18R1，以及探针18P1；所述引物18F1的序列为GCCCTCGCAAACGTTCTG，所述引物18R1的序列为CACACGCTTGGCAGGTTTAG，所述探针18P1的序列为VIC?TCCATCTGCCACTACGT?MGB?NFQ。

【技术特征摘要】
2012.07.13 CN 201210244357.51.一种用于人乳头瘤病毒18(HPV18)基因检测的试剂盒，其包括DNA提取液，HPV18PCR反应液，HPV18强阳性质控品和阴性质控品，其中: 所述HPV18PCR反应液包括超纯水，缓冲液，dNTP，引物18F1和18R1，以及探针18P1 ； 所述引物18F1的序列为GCCCTCGCAAACGTTCTG，所述引物18R1的序列为CACACGCTTGGCAGGTTTAG，所述探针 18P1 的序列为 VIC-TCCATCTGCCACTACGT-MGB NFQ。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括:DNA提取液2管；HPV18PCR反应液20管；HPV18强阳性质控品I管；阴性质控品I管。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括:DNA提取液2管，500μ I/管；HPV18PCR反应液20管，19 μ I/管；HPV18强阳性质控品I管，200 μ I/管；阴性质控品I管，150μ I/管；其中，所述HPV18PCR反应液包括超纯水14.3 μ 1，IOXbuffer缓冲液2 μ 1，dΝΤΡ0.4 μ 1，引物 18F10.4μ 1,18R10.4μ 1，探针 18Ρ10.4μ I。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述引物是由包括CPG、四氮唑、乙酸酐和1-甲基咪唑、碘、dNTP的原料合成，并且根据HPV的不同分型而设计。5.用于制备权利要求1所述的试剂盒的方法，其包括下述步骤: 1)确定待测基因片段:根据科技文献的方向性报道初步选定候选基因片断，然后经研发过程中与待检样本病理相关性的比较，最终确认与临床疾病最具相关性的待测基因片断； 2)根据所述待测基因片段设计并生产引物和探针，采用多核苷酸合成仪生产所述引物； 3)提取细胞基因组DNA:用DNA提取液提取病人基因组及对照组基因组DNA ； ...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟建，方平科，
申请(专利权)人：钟建，
类型：发明
国别省市：