一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，适用于具有脉冲激发光和连续损耗光的STED超分辨显微系统，首先对样品进行横向二维扫描，根据得到荧光寿命分布和荧光光斑进行横向对准，然后对单颗荧光颗粒进行轴向扫描成像，分析带有荧光强度与寿命分布的轴向二维图像，调节连续损耗光的发散度，完成光斑的轴向对准。本发明专利技术还公开了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置。本发明专利技术装置结构简洁，方便快速高精度调整，无需因采用纳米金颗粒而添加额外探测光路；调节精度高，光斑对准精度可达纳米量级。

Nano precision spot alignment method and device based on fluorescence lifetime distribution

The invention discloses a nanometer precision alignment method based on spot fluorescence lifetime distribution, suitable for pulse excitation and continuous loss of the optical STED super resolution microscopy system, first horizontal two-dimensional scanning of samples obtained according to fluorescence lifetime distribution and fluorescent spot in transverse alignment, then axial scanning imaging of single fluorescence particle analysis with fluorescence intensity and lifetime distribution of two-dimensional axial images, adjusting the continuous loss of light beam divergence, complete axial alignment. The invention also discloses a nanometer precision spot aligning device based on the fluorescence lifetime distribution. The device has the advantages of simple structure, convenient, fast and high precision adjustment, no additional detection light path required by adopting nano gold particles, high adjustment accuracy, and nanometer spot alignment precision up to nanometer magnitude.

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，适用于具有脉冲激发光和连续损耗光的STED超分辨显微系统，首先对样品进行横向二维扫描，根据得到荧光寿命分布和荧光光斑进行横向对准，然后对单颗荧光颗粒进行轴向扫描成像，分析带有荧光强度与寿命分布的轴向二维图像，调节连续损耗光的发散度，完成光斑的轴向对准。本专利技术还公开了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置。本专利技术装置结构简洁，方便快速高精度调整，无需因采用纳米金颗粒而添加额外探测光路；调节精度高，光斑对准精度可达纳米量级。【专利说明】一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置
本专利技术属于光学超分辨显微领域，特别涉及一种受激发射损耗显微术中基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置。
技术介绍
共聚焦荧光显微术具有非侵入性、高特异性和高灵敏度等优点，一直是生命科学领域中的重要研究方法。但是由于光波的衍射效应，其成像分辨率被局限于半个波长左右，无法满足当前生命科学的研究需求。为了打破光波衍射极限的限制，进一步探索生命的本质和疾病的机理，科学家们致力于超分辨光学显微术的研究，自20世纪90年代起，已提出了多种光学超分辨显微方法:受激发射损耗显微术(Stimulated emission depletion microscopy, STED),光激活定位显微术(photoactivated localization microscopy, PALM),随机光学重建显微术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM),饱和结构光照明显微术(saturated structured illumination microscopy, SSIM),等等。在这些方法之中，STED超分辨显微术目前具有最快的记录速度和最具前途的应用前景。STED超分辨显微术首先是由S.ff.Hell于1994年提出的。在一个标准的STED超分辨显微系统中，一束相位编码的红移损耗光被引入共焦系统，通过高数值孔径显微物镜的聚焦在焦平面产生一个环形中空光斑(donut spot)。损耗光通过受激辐射作用消耗掉激发光实心聚焦光斑外围的激发电子，抑制光斑外围的自发荧光效应进而获得更小的有效点扩散函数(Point Spread Function, PSF)。因此,最佳的STED成像效果需要激发光的实心聚焦光斑中心和损耗光的环形中空聚焦光斑中心精确重合。传统的方法中，两聚焦光斑中心对准是通过两束光分别扫描纳米金颗粒进行成像，然后通过对比两幅像调整两束光聚焦光斑的相对位置，多次重复直至光斑中心重合。这种对准方法存在以下几个缺点:①需要额外添加散射光成像光路:因为STED显微系统本身针对荧光波长，收集部分装有滤除激发光和损耗光的滤光片，而纳米金颗粒则是利用激发光和损耗光的散射光来成像，因此若要采用纳米金颗粒对准需要添加额外光路；②激发光和损耗光需要单独扫描成像，其间的样品漂移会产生误差需要校正:常见的采集系统多采用雪崩二极管(APD)来记录扫描强度，但是APD无法分辨收集信号的波长，因此激发光和损耗光需要单独扫描成像，对比两次扫描结果，势必会引入样品漂移误差。2013年，有国外课题组提出了采用荧光颗粒对STED中两束光的聚焦光斑中心进行对准(Auto-aligning stimulated emission depletion microscopeusing adaptive optics.0ptics letters, 2013),但是其方法并没有克服分时扫描引入样品漂移误差等问题，另外该方法是通过荧光强度分布来确定聚焦光斑中心的，荧光强度分布依赖于激发光和损耗光的强度比。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置，通过探测STED显微术中由于损耗光引起的荧光光斑横向和纵向荧光寿命分布变化，调整寿命点扩散函数中心与对应荧光聚焦光斑中心的相对位置，从而对两聚焦光斑的中心进行三维对准。本专利技术结构简单，无需采用纳米金颗粒，无需添加额外光路，无需分时扫描成像，对准精度在纳米量级，特别适用于激发光为脉冲光、损耗光为连续光的STED超分辨显微系统。一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，适用于具有脉冲激发光和连续损耗光的STED超分辨显微系统，包括以下几个步骤:I)同时启用脉冲激发光和连续损耗光，所述的脉冲激发光和连续损耗光转换为圆偏光后经显微物镜聚焦到荧光样品表面，收集荧光颗粒发出的荧光，得到聚焦点的荧光强度和荧光寿命；2)横向移动所述的荧光样品，重复步骤1)，获得对应扫描区域内各扫描点的荧光强度信息和突光寿命信息；3)对步骤2)获得的荧光强度信息和荧光寿命信息进行分析，选择单颗荧光颗粒的突光强度光斑、拟合光斑中心并记录光斑中心坐标，同时提取所述突光强度光斑对应的寿命分布，拟合寿命的最长点并记录最长点坐标，计算得到光斑中心与寿命最长点的距离；4)根据步骤3)算得的距离，改变所述连续损耗光入射显微物镜的角度，使光斑中心与寿命最长点完全重合，完成光斑的横向对准；5)对步骤3)中选择的单颗荧光颗粒，重复步骤I)中的操作，选取穿过颗粒中心的轴向切面进行扫描，并移动所述的突光样品完成轴向二维扫描，获得对应各点的突光强度信息和荧光寿命信息；6)根据步骤5)中单颗荧光颗粒的椭圆荧光光斑及所述荧光光斑对应的寿命分布，调节所述连续损耗光的发散度，使得长寿命区域贯穿荧光光斑的中间区域且沿椭圆荧光光斑长轴和短轴呈轴对称分布，完成光斑的轴向对准。以荧光样品的颗粒稀疏区域作为所述步骤2)中的扫描区域，所述颗粒稀疏区域确定方法为:单独使用脉冲激发光，并将脉冲激发光调制为圆偏光，然后由显微物镜聚焦到样品表面，对样品表面进行二维扫描，收集荧光颗粒发出的荧光，得到相应的扫描图像，根据所述扫描图像上荧光颗粒的分布，选取所述的颗粒稀疏区域。其中，脉冲激发光在经过脉冲激发光快门之前已调制为平行光；连续损耗光在经过连续损耗光快门之前已调制为平行光，且已经过了相位调制，相位调制的作用是为了在之后在显微物镜的聚焦作用下聚焦光斑成中空面包圈形光斑。其中，脉冲激发光经显微物镜的聚焦光斑与最终收集信号的多模光纤端面在系统中互为共轭点。其中，所述的荧光样品为100纳米荧光颗粒，因为100纳米荧光颗粒有较好的抗漂白能力，也可以采用40纳米?80纳米尺寸的荧光颗粒。在步骤2)中，还可以采用振镜扫描系统来实现样品的横向扫描。本专利技术还提供了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，包括:沿脉冲激发光光路依次布置的脉冲激发光生成装置和脉冲激发光快门；沿连续损耗光光路依次布置的连续损耗光生成装置、连续损耗光快门和二色镜；四分之一波片，用于将所述的脉冲激发光和连续损耗光调制为圆偏光；显微物镜，用于将所述圆偏光聚焦至荧光样品并收集荧光；信息采集装置，用于采集所述显微物镜收集荧光的强度信息和寿命信息；以及与所述信息采集装置连接的计算机。其中，所述的脉冲激发光生成装置包括沿光路依次布置的脉冲激光器、第一单模保偏光纤、第一准直透镜、第一起偏器、第一四分之一波片和第一二分之一波片。其中，所述的连续损耗光生成装置包括沿光路依次布置的连续激光器、第本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，适用于具有脉冲激发光和连续损耗光的STED超分辨显微系统，其特征在于，包括以下几个步骤：1）同时启用脉冲激发光和连续损耗光，所述的脉冲激发光和连续损耗光转换为圆偏光后经显微物镜聚焦到荧光样品表面，收集荧光颗粒发出的荧光，得到聚焦点的荧光强度和荧光寿命；2）横向移动所述的荧光样品，重复步骤1），获得对应扫描区域内各扫描点的荧光强度信息和荧光寿命信息；3）对步骤2）获得的荧光强度信息和荧光寿命信息进行分析，选择单颗荧光颗粒的荧光强度光斑、拟合光斑中心并记录光斑中心坐标，同时提取所述荧光强度光斑对应的寿命分布，拟合寿命的最长点并记录最长点坐标，计算得到光斑中心与寿命最长点的距离；4）根据步骤3）算得的距离，改变所述连续损耗光入射显微物镜的角度，使光斑中心与寿命最长点完全重合，完成光斑的横向对准；5）对步骤3）中选择的单颗荧光颗粒，重复步骤1）中的操作，选取穿过颗粒中心的轴向切面进行扫描，并移动所述的荧光样品完成轴向二维扫描，获得对应各点的荧光强度信息和荧光寿命信息；6）根据步骤5）中单颗荧光颗粒的椭圆荧光光斑及荧光光斑对应的寿命分布，调节所述连续损耗光的发散度，使得长寿命区域贯穿荧光光斑的中间区域且沿椭圆荧光光斑长轴和短轴呈轴对称分布，完成光斑的轴向对准。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：匡翠方，王轶凡，刘旭，修鹏，方月，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：