一种畜禽免疫增强剂法氏囊多肽制造技术

本发明专利技术涉及一种畜禽免疫增强剂法氏囊多肽。本发明专利技术所述的免疫增强剂法氏囊多肽其是一种小分子多肽，本发明专利技术免疫增强剂具有广泛的免疫增强作用，对多种畜禽具有刺激淋巴细胞增殖、调节细胞因子和提高疫苗免疫效力作用，该多肽的氨基酸序列为：COOH-G-H-K-T-R-N-D-P-L-K-G-A-V-D-NH2。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种畜禽免疫增强剂法氏囊多肽。本专利技术所述的免疫增强剂法氏囊多肽其是一种小分子多肽，本专利技术免疫增强剂具有广泛的免疫增强作用，对多种畜禽具有刺激淋巴细胞增殖、调节细胞因子和提高疫苗免疫效力作用，该多肽的氨基酸序列为：COOH-G-H-K-T-R-N-D-P-L-K-G-A-V-D-NH2。【专利说明】一种畜禽免疫增强剂法氏囊多肽
本专利技术涉及一种畜禽免疫增强剂法氏囊多肽，属于兽医生物制品
。
技术介绍
疫苗免疫一般认为是防治畜禽传染病最有效和最经济的手段之一。然而，传统疫苗和新型疫苗也遇到了一些难以解决的问题:疫苗对某些群体的免疫效力低下；需要反复免疫才能产生较好的免疫力；疫苗保护力易随时间推移而严重降低；甚至某些传染病尚无有效疫苗防治等。因此，很多疫苗，尤其是亚单位疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗等新型疫苗必须产生更强大和更持久的免疫反应才能满足需要。佐剂作为能够提高疫苗免疫效果的一类重要物质，受到了广泛研究和应用。迄今，人们发现许多物质具有免疫佐剂活性，但其中大多数由于造价高昂或具有毒副作用而未得到实际应用。近年来，免疫机理的快速深入探索，为寻找更加廉价、高效、安全的新型佐剂开辟了道路。法氏囊(Bursa of Fabricius，BF)是禽类特有的中枢免疫器官，在B淋巴细胞分化和抗体产生中起着重要的作用。法氏囊中许多多肽具有免疫增强作用。本专利技术即分离、鉴定出一个新的法氏囊多肽(BP14)，可作为畜禽免疫增强剂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种廉价、高效、安全的新型免疫增强剂。本专利技术通过浓缩、纯化大量家禽法氏囊提取物，再经高效液相分离、收集各种组分。将各组分以一定浓度与疫苗共同免疫动物，发现了其中一种组分具有较好的免疫增强作用，添加该组分的实验组疫苗免疫效力显著高于未加该组分的疫苗对照组。将该组分进行氨基酸测序，发现其氨基酸序列为COOH-G-H-K-T-R-N-D-P-L-K-G-A-V-D-NH2 (即5’-GlyHis Lys Thr Arg Asn Asp Pro Leu Lys Gly Ala Val Asp_3’，序列 I),并命名为法氏囊多肽(BP14)。1.法氏囊多肽BP14的制备(1)通过人工合成BP14，以一定浓度进行验证实验，结果该多肽表现出同样的免疫增强作用。免疫增强剂多肽BP14的多个串联体C00H-G-H-K-T-R-N-D-P-L-K-G-A-V-D—G-H-K-T-R-N-D-P-L-K-G-A-V-D-NH2 (即 5，-Gly His Lys Thr Arg Asn Asp Pro Leu LysGly Ala Val Asp Gly His Lys Thr Arg Asn Asp Pro Leu Lys Gly Ala Val Asp_3，序列2)和/或COOH-G-H-K-T-R-N-D-P-L-K-G-A-V-D-G-H-K-T-R-N-D-P-L-K-G-A-V-D-G-H-K-T-R-N-D-P-L-K-G-A-V-D-NH2 (即 5， -Gly His Lys Thr Arg Asn Asp Pro Leu Lys Gly AlaVal Asp Gly HisLys Thr Arg Asn Asp Pro Leu Lys Gly Ala Val Asp Gly His Lys ThrArg Asn Asp Pro Leu Lys Gly Ala Val Asp_3’，序列3),具有相同的免疫增强作用。(2)通过查询BP14各氨基酸的密码子，获得其编码基因，如5 ’ -GGUCAUAAAACUAGGAAUGACCCUCUGAAGGGUGCUGUUGAU-3，(序列 4)和 / 或5，-GGUCAUAAAACUAGGAAUGACCCUCUGAAGGGUGCUGUUGAUGGUCAUAAAACUAGGAAUGACCCUCUGAAGGGUGCUGUUGAU-3，(序列 5)。将该基因插入大肠杆菌表达载体，如:插入了5，-GGUCAUAAAACUAGGAAUGACCCUCUGAAGGGUGCUGUUGAU-3，序列的质粒 DH5 a -BP14和/或插入了5，-GGUCAUAAAACUAGGAAUGACCCUCUGAAGGGUGCUGUUGAUGGUCAUAAAACUAGGAAUGACCCUCUGAAGGGUGCUGUUGAU-3’序列的质粒pET32a_2BP14，收集表达产物，表达产物具有类似免疫增强作用。2.法氏囊多肽BP14的(I)将免疫增强剂BP14，按照不同目标动物使用不同剂量添加畜禽疫苗中进行联合接种；免疫后的动物的抗体水平高于疫苗组；受试动物产生较高水平的细胞因子。禽的使用剂量为0.1 μ g/羽份,猪为5μ g/头份。(2)本专利技术所述的畜禽免疫增强剂BP14在疫苗生产过程中，按照疫苗终产品中BP14的含量为比例将其添加禽用疫苗抗原液中再配制成水相，再按常规法与油相混合乳化成畜禽用疫苗。【专利附图】【附图说明】图1免疫后1-12周鸡血清H5抗体水平，*表示差异显著(p〈0.05)图2图1.2免疫 后1-12周鸡血清中IFN-Y (图2_1)和IFN-β (图2_2)的产量用不同字母标记的各组之间差异显著(p〈0.05)。ns代表无显著性差异。图3免疫后14 (图3-1)和28天(图3-2)猪细胞因子的产生，用不同字母标记的各组之间差异显著(ρ〈0.05)图4免疫前后的PCV抗体水平图5攻毒后各组动物的体温变化。本专利技术的积极意义本专利技术涉及一种畜禽免疫增强剂法氏囊多肽。本专利技术所述的免疫增强剂法氏囊多肽其是一种小分子多肽，本专利技术免疫增强剂具有广泛的免疫增强作用，对多种畜禽具有刺激淋巴细胞增殖、调节细胞因子和提高疫苗免疫效力作用，该多肽的氨基酸序列为:COOH-G-H-K-T-R-N-D-P-L-K-G-A-V-D-NH2。具体实施例本专利技术的实施例为进一步描述本专利技术的技术方案，但不构成对本专利技术的限制。实施例1——ΒΡ14作为重组禽流感病毒灭活疫苗(Η5Ν1亚型，Re-6株)的免疫增强剂1.人工合成BP14 委托商业化多肽合成公司按照COOH-G-H-K-T-R-N-D-P-L-K-G-A-V-D-NH2氨基酸序列(序列I)合成多肽，要求纯度兰95%。 2.疫苗重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型，Re-6株)为商品化的疫苗(生产厂:广东永顺生物制药股份有限公司，批号:2013037)。3.实验动物分组将40只SPF鸡随机分为四组，每组10只:(I)重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型，Re-6株)免疫组(每只免疫灭活疫苗I羽份/0.25ml) ； (2)灭活疫苗+BP14组(按每羽份灭活疫苗+0.1 μ g BP14的比例无菌手续配制；BP14对照组(每只鸡注射BP14(0.1 μ g/0.25ml)) ；PBS 对照组(每只免疫 0.25ml PBS)。4.样品采集免疫后第I~12周，每周每只鸡翅静脉采抗凝血lmL，8000Xg离心IOmin分离血清，-20°C冷冻保存，最后一并测定抗体效价和细胞因子表达水平，再进行统计分析。5.结果( I)抗体水平测定结果特异性抗体水平通过红细胞凝集抑制试验(HI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小分子多肽，其氨基酸序列为COOH?G?H?K?T?R?N?D?P?L?K?G?A?V?D?NH2。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：傅宏庆，姚志兰，张响英，卢炜，刘静，
申请(专利权)人：江苏农牧科技职业学院，
类型：发明
国别省市：