本发明专利技术涉及养殖海参腐皮病综合症病原菌的检测技术领域，具体的说，涉及一种快速检测海参腐皮病综合症之主要病原菌灿烂弧菌的方法。本发明专利技术用于克服现有海参海参腐皮病综合症主要病原菌——灿烂弧菌检测技术的不足，提供一种快速检测海参腐皮病主要病原菌灿烂弧菌的方法。将细菌纯培养物离心、清洗，冻融、煮沸，作为模板进行LAMP扩增；针对灿烂弧菌flgF基因设计LAMP引物；配置并优化反应体系，65℃温浴45min，肉眼或电泳判断结果。本发明专利技术首次将LAMP技术应用于海参腐皮病综合症病原菌——灿烂弧菌的检测当中，具有耗时短，成本低，简便易用等优点，适于在基层推广。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及养殖海参腐皮病综合症病原菌的检测
，具体的说，涉及一种快速检测海参腐皮病综合症之主要病原菌灿烂弧菌的方法。本专利技术用于克服现有海参海参腐皮病综合症主要病原菌——灿烂弧菌检测技术的不足，提供。将细菌纯培养物离心、清洗，冻融、煮沸，作为模板进行LAMP扩增；针对灿烂弧菌flgF基因设计LAMP引物；配置并优化反应体系，65℃温浴45min，肉眼或电泳判断结果。本专利技术首次将LAMP技术应用于海参腐皮病综合症病原菌——灿烂弧菌的检测当中，具有耗时短，成本低，简便易用等优点，适于在基层推广。【专利说明】
:本专利技术属于养殖海参腐皮病综合症病原菌的检测
，具体的说，涉及一种快速检测海参腐皮病综合症之主要病原菌灿烂弧菌的方法。
技术介绍
:据不完全统计，我国每年因水产养殖病害问题而造成的直接经济损失高达数百亿元。研究开发用于水产养殖病害诊断分析的技术，尤其是对于水产养殖病害的早期诊断分析试剂(盒)，为实现对水产养殖动物病害病原的准确、灵敏检测及疫病的早期快速诊断具有很高的实用价值。海参腐皮病综合征是一种养殖海参常见病，具有特点发病广，涉及所用的刺参养殖区；发病快，一旦发病很快蔓延全池；危害重，可造成90%以上的死亡率等特点。给海参养殖户造成了很大的损失。关于海参腐皮病综合症病原菌的研究与分析已有文献报道，其中灿烂弧菌被认为是腐皮病综合征的主要病原之一。在人工感染条件下可以导致健康海参呈现腐皮病的特征 。关于灿烂弧菌的检测及分析技术已有相关的报道。包括基于16s-23s核糖体RNA间隔序列的PCR检测方法，基于抗原抗体反应的Dot-ELISA方法等。这些方法特异性较强，可以实现灿烂弧菌的快速鉴定。但存在需要昂贵的检测仪器(基因扩增仪)、制备抗体等不足，对结果的判读需要一定的生物学甚至分子生物学知识，这些限制了其在基层特别是养殖场的推广应用。环介导的核酸等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP)是2000年由日本学者Notomi T等提出。通过对靶基因的6个不同区域设计2对特异性引物，利用具有链置换功能的DNA聚合酶，在等温条件下(65°C左右)实现核酸的扩增反应，由于扩增的片段很小，扩增效率很高，结果的判定可以通过是否产生焦磷酸镁白色浑浊来判读。由于LAMP具有高灵敏(比传统PCR高出2-5个数量级)、高效性(反应时间30-60min)、成本低廉(无需PCR仪)、结果判读简单(目视)等优越特点，被认为是新型的PCR替代技术。从2003年开始，LAMP逐步应用到病原微生物的检测和传染性疾病的诊断中。在日本，LAMP技术已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫等疾病的检测，食品化妆品安全监测及进出口快速检疫中，并成功开发为诊断试剂推向国内及国际市场。LAMP技术应用于食品及水产动物病害的检测分析的研究中，国内业已有相关文章和专利报道。如针对贝类中副溶血弧菌的检测中，研究者以特异性gyrB基因为靶基因设计引物，对纯培养的副溶血弧菌的检测限度可达1900CFU/mL ;利用霍乱弧菌种特异性的epsM基因和CtxA基因设计引物，可以快速检测霍乱弧菌；利用石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的0RF-041L设计引物，利用LAMP实现SGIV感染石斑鱼的检测等等。
技术实现思路
:本专利技术首次将LAMP技术应用于海参腐皮病综合症病原菌——灿烂弧菌的检测当中，用于克服现有海参海参腐皮病综合症主要病原菌——灿烂弧菌检测技术的不足，提供一种利用LAMP技术快速检测灿烂弧菌的方法。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术采用如下技术方案，采用环介导等温核酸扩增检测方法(LAMP)。具体的制备步骤为，1、LAMP模板的制备将细菌纯培养物依次进行离心、清洗、冻融和煮沸，得到LAMP模板。2、基因序列分析及引物设计比照已报道(网络数据库资料:http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)的弧菌属细菌毒力相关因子，选择弧菌属细菌中普遍存在的鞭毛相关基因flgF，通过GenBank数据库查找已知弧菌flgF的全基因及蛋白质序列。利用DNAMAN软件对获得的9株弧菌flgF完整DNA及蛋白质序列进行比对分析。筛选灿烂弧菌DNA序列中的有别于其他弧菌的特殊区域。通过上述分析，选择灿烂弧菌中保守区域作为引物区域。引物设计采用Primerpremier5.0引物设计软件。设计的LAMP引物序列为:正向外引物F3:5'-GGATCGCGCACTGTTTCT-3'反向外引物B3:5'-TGTGCGAAATTATGACCCGG-3'正向内引物FIP:5'-ACCCGTTGTACTTACGTTGGCAGCCATGAGTGGCGCTAAG-3'反向内引物BIP: 5'-AGCACAAGCACGTTCAATGCAACCGTCATGCTGAAAACACGA-3'。3、扩增反应将制得的LAMP模板和LAMP引物混合进行扩增反应，25 μ L的反应液中含LAMP模板0.2-0.4 μ L，浓度为IOuM的正向外引物F30.5-1 μ L，浓度为IOuM的反向外引物Β30.5-1 μ L，浓度为20uM的正向内引物FIP 1.5-2.5 μ L，浓度为20uM的反向内引物BIP 1.5-2.5 μ L，浓度为IOOmM的MgSO4L 5-4 μ L，浓度为IOmM的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 1.5-3 μ L，浓度为5Μ的甜菜碱4_5 μ L，浓度为IOX的Bst DNA聚合酶缓冲液2.5 μ L，浓度为8000U/mL的Bst DNA聚合酶(大片段)0.5-1 μ L，余量为双蒸水(ddH20)，反应液在60-65°C下反应30-60min ;然后置于80_85°C下终止反应8_10min。优化反应体系,65 °C温浴反应45min.4、通过浊度观察、离心观察和电泳观察对结果进行分析。(I)浊度观察:若反应后的产物与阴性对照管明显显示白色絮状浑浊，证明所测菌株为灿烂弧菌，反之亦然。(2)离心观察:将反应后的产物常温下5000-6000rpm离心10_30s，若反应管底部见白色沉淀，则待测菌株为灿烂弧菌，反之亦然。(3)电泳观察:将反应产物与DNA电泳上样缓冲液混合后，于1.5%琼脂糖凝胶电泳，80-100V电泳20-30min，EB染色，紫外下观察若见梯形条带，则待测菌株为灿烂弧菌，反之亦然。本专利技术的有益效果:本专利技术具有灵敏度高、特异性强，检测方法简单易操作，耗时短，无需昂贵仪器，检测成本低廉等特点。适合快速检测海参腐皮病综合征之一的灿烂弧菌病原，尤其适用于基层检验检疫机构或养殖场进行相关病原菌的检测和分析，为提高食品卫生安全水平和进行疾病的早期检测和防控具有重要意义。【专利附图】【附图说明】:图1为flgF序列分析及引物设计区域示意图。图2为LAMP引物设计示意图，其中黑色框架包围的区域为引物设计区域。图3为实施例1的LAMP浊度检测结果示意图:其中，I为无添加DNA模板；2为添加灿烂弧菌DNA的模板。A为LAMP结束后肉眼观察的反应体系浊度变化情况，C为A的管底部放大图；B，LAMP反应结束后离心后观察到的沉淀情况，D为B的管底部放大图。图4为不同反应时本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测海参腐皮病主要病原菌灿烂弧菌的方法，其特征在于，采用环介导等温核酸扩增检测法。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：焦绪栋，秦松，孙秀娟，蒋婷，李莉莉，王义鹏，
申请(专利权)人：中国科学院烟台海岸带研究所，
类型：发明
国别省市：
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