本发明专利技术公开一种表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列及其应用。该编码序列如SEQ?ID?NO.1所示。该编码序列用于CVN突变体，包括如下步骤：将上述编码核苷酸序列克隆到表达载体上，得到重组载体；将重组载体转化到宿主细胞中进行表达，纯化，得到表达量高和活性强的CVN突变体。该编码序列显著促进了CVN在大肠杆菌中的可溶性表达，CVN突变体在大肠杆菌中可溶性表达的量显著高于野生型CVN。此外，由该编码序列得到的CVN突变体的体外抗流感病毒活性要好于野生型CVN，说明通过翻译暂停理论对蛋白质编码核苷酸序列理性设计和优化，不仅能够提高CVN的表达量，更为重要的是显著促进CVN可溶性表达，得到生物活性更好的CVN蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列及其应用。
技术介绍
蓝藻抗病毒蛋白N (cyanovirin-N, CVN)是Boyd等1997年在蓝藻中发现的一种抗病毒蛋白，能特异、高亲合性地结合与病毒表面衣壳蛋白gpl20上的甘露寡糖结合，阻止病毒与宿主细胞表面的受体结合，并阻止病毒在感染细胞和正常细胞之间的传播，这一特点使它可以不受病毒变异的干扰，不易引起耐药性。CVN蛋白低浓度(0.1 36.8nM)能有效抑制HIV感染免疫细胞，高浓度(45 400nM)对正常细胞无直接的毒副作用。除HIV外，CVN对流感病毒、疱疹病毒和副流感病毒等都有拮抗作用，是一种作用广谱、高效、非常有应用价值的抗病毒候选药物，备受关注。但是，CVN的大规模制备一直是限制其应用的瓶颈技术。目前报道CVN在大肠杆菌中都是以包涵体形式表达，受到表达量低、产物不均一、错误修饰等多种因素限制(Mori, T., Gustafson, K.R., RecombinantProduction of Cyanovirin-N, a Potent Human Immunodeficiency Virus-1nactivatingProtein Derived from a Cultured Cyanobacterium.Protein Expression andPurification, 1998，151-158);也有人尝试在转基因植物中表达CVN，但是没有建立可实施的纯化工艺(Sexton, A., Drake, P.Μ., Mahmoodj Transgenic plant production ofCyanovirin-N, an HIV microbicide.2006, Vol.20pp.356-358)。传统生化理论“安芬森原 则”认为，蛋白质的折叠信息由其氨基酸序列在一定环境下唯一决定(Taniuchi H., D.R.Davies, and C.B.Anfinsenj A comparison of the x-raydiffraction patterns of crystals of reconstituted nuclease—T and of nativestaphylococcal nuclease.J Biol Chem, 1972.247 (10):p.3362-4)。但本专利技术人的研究指出，这一传统理论有误。不同的DNA虽然可以翻译成同样的氨基酸，蛋白质生成的速度(翻译速度)并非恒定，在某些区段上会比较缓慢，这种现象称为翻译暂停(translationalpausing或translational attenuation)翻译暂停位点与蛋白质折叠高度相关，若翻译暂停位点不正确，该慢的地方快了，或者该快的地方慢了，都将导致蛋白质错误折叠聚集，无法得到有功能的可溶性蛋白。也就是说，蛋白质空间构象不仅由氨基酸的序列决定，也由核苷酸序列决定。(Zhang G., M.Hubalewskaj and Ζ.Ignatova, Transient ribosomalattenuation coordinates protein synthesis and co-translational folding.NatStruct Mol Biol, 2009.16(3):p.274-80.；Zhang G.and Z.1gnatova, Folding at thebirth of the nascent chain: coordinating translation with co-translationalfolding.Curr Opin Struct Biol, 2011.21 (I):p.25-31.)D 这一理论适用于蛋白组中绝大部分蛋白质(Zhang，G.and Z.1gnatova, Generic algorithm to predict thespeed of translational elongation:1mplications for protein biogenesis.PLoSOne,2009.4(4):p.e5036.；Fedyunin,1.,et al.,tRNA concentration fine tunesprotein solubility.FEBS Lett, 2012.586(19):p.3336-40.)
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列。本专利技术的另一目的在于提供通过上述编码序列得到的CVN突变体。本专利技术的再一目的在于提供所述的表达量高和活性强的CVN突变体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列，如下所示:CTTGGTAAATTCTCCCAGACCTGCTACAACTCCGCTATCCAGGGTTCTGTTCTGACCTCTACCTGCGAACGTACCAACGGTGGTTACAACACCTCCTCTATCGACCTGAACTCCGTTATCGAAAACGTTGACGGTTCTCTGAAATGGCAGCCGTCTAACTTCATCGAAACCTGCCGTAACACCCAGCTGGCTGGTTCCTCTGAACTGGCTGCTGAATGCAAAACCCGTGCTCAGCAGTTCGTTTCTACCAAAATCAACCTAGACGACCATATAGCTAACATAGACGGTACACTAAAATACGAA。一种表达量高和活性强的CVN突变体，由上述编码序列制备得到；所述的的表达量高和活性强的CVN突变体，通过如下方法制备得到:将上述编码序列克隆到表达载体上，得到重组载体；将重组载体转化到宿主细胞中进行表达，纯化，得到表达量高和活性强的CVN突变体；所述的表达载体优选为pET_28b ；所述的宿主细胞优选为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)；所述的表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列在制备CVN突变体中的应用，包含如下步骤:(I)设计如下的引物:F-sumo:5’ -GGAATTCCATATGGGCATGTCGGACTCAGAAGTC-3’ ；R-CVN:5’ -TTCCGCGGCCGCTATGGCCGACGTCGACTTCGTATTTCAGGGTACCGTC-3’ ；F1-mutant:5’ -GACGACCACATCGCTAACATAGACGGTACACTAAAATACGAATGATGAGTCGAC-3，；Rl-mutant:5’ -GTCGACTCATCATTCGTATTTTAGTGTACCGTCTATGTTAGCGATGTGGTCGTC-3，；(2)第一次PCR扩增:以pET-3c-SUM0-CVN质粒为模板，以F-sumo/R-CVN为引物进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化后使用NdeI和SalI双酶切；将双酶切后的PCR产物与经过NdeI和SalI双酶切的载体pET_28b，连接；连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 α感受态细胞，筛选，得到本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列，其特征在于：如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，张弓，熊盛，金静洁，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。