一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用黑曲霉菌(Aspergillus?niger)转化生产优质沉香的方法，包括如下步骤：对黑曲霉菌种An-53CCTCC?M2012304进行菌种分离、纯化和鉴定；对黑曲霉进行发酵培养；对黑曲霉的发酵液经过过滤和浓缩制得黑曲霉胞外酶浓缩液；黑曲霉胞外酶转化合成优质沉香。本发明专利技术方法简便、用途广泛，生产的沉香条可用于燃香和入药，操作简便、成本低廉、无需专业设备适合沉香种植户；本发明专利技术可生产用于高档工艺品制作的大尺寸沉香块，适合大面积种植沉香的基地或企业，实现沉香的量产并能够大幅度提高沉香质量等级；通过发酵法可以直接将沉香树干粉末转化合成优质沉香油并用于生产香水。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于沉香生产
，具体的说是涉及一种采用转化合成沉香的黑曲霉胞外酶制备转化合成优质沉香的方法。
技术介绍
沉香是瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg含树脂的木材,是我国、印度及其他东南亚国家的传统名贵中药，具有行气止痛、纳气平喘、温中止呕的功效。同时，其具有浓郁而独特的香气，故常被用来制造高级香水、高级香精等。白木香是国产沉香的唯一植物资源，其树干在受到损伤或刺激的情况下才能分泌沉香树脂，但这需要十几年甚至几十年的累积。天然沉香的偶然性及长周期性已远不能满足市场需求，人们便开始使用各种人工促香方法促进白木香结香并且从未间断对沉香形成机制的探索。虽然白木香结香机制尚未明确，但普遍认为沉香的形成可能是由于树干损伤后被一种或数种真菌侵入寄生，在真菌体内酶的作用下，使木薄壁细胞贮存的淀粉发生一系列变化，形成香脂，经多年沉积而得。一直以来，国内学者也进行着人工结香方面的研究。1976年，广东植物研究所对凿洞后1、6、12、18、24个月的5批白木香样品进行了组织化学和解剖学研究。组织化学研究结果显示，木材薄壁细胞内的淀粉依次经过中间产物非淀粉的多糖、醛类或酮类及酚类化合物转化成了沉香。该研究小组又成功地从白木香中分离了黄绿墨耳菌Menanotus flavolives,并证实该菌可大大加速沉香的转化合成进程,并证实沉香形成是由于由于真菌寄生并分泌的酶类作用下，使木材组织薄壁细胞储存的淀粉产生一系列的变化，最后形成沉香树脂。但是，由于黄绿墨耳菌生长繁殖受气候和环境条件影响较大，该菌株在白木香树干生长非常缓慢，导致结香效率不高且不稳定，导致该菌一直未能实现规模化推广使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对目前缺乏有效沉香转化菌株的现状，克服现有技术中存在的不足，提供，从而能够实现规模化生产沉香。本专利技术是通过以下技术方案实现的:，沉香转化真菌菌株为黑曲霉(Aspergillus niger),其包括如下步骤:a、首先对黑曲霉菌种An_53CCTCC M2012304进行菌种分离、纯化和鉴定步骤，从野生高品质沉香中分离纯化黑曲霉菌，并对分离出的黑曲霉菌进行形态学鉴定；b、然后对黑曲霉进行培养，包括活化培养、种子液培养和发酵培养；C、对黑曲霉的发酵液经过过滤和浓缩步骤，制得黑曲霉胞外酶浓缩液；d、黑曲霉胞外酶转化合成优质沉香:固化菌株接种刺激造香，发酵液或胞外酶浓缩液注入沉香树转化生产沉香；发酵液或胞外酶浓缩液转化木屑合成沉香油。步骤a菌种分离过程中菌种分离筛选培养基的制备方法为:35目沉香树干粉末煮沸25min 35min,纱布过滤,定容至IOOOmL,加入0,8% 1.2%葡萄糖，I % 2%琼脂,在pH为7 8、110°C 130°C的条件下灭菌25min 35min。作为本专利技术的最佳实施方案:步骤a菌种分离过程中菌种分离筛选培养基的制备方法为:35目沉香树干粉末煮沸30min,纱布过滤,定容至IOOOmL,加入1%葡萄糖，1.5%琼脂，在pH为7.5、121.5°C的条件下灭菌30min。步骤c发酵培养过程中发酵培养基的制备方法为:35目沉香树干粉末煮沸25min 35min,用纱布过滤,加入 80g 120g 葡萄糖、0.3g 0.4g ΚΗ2Ρ04、0.Ig 0.2gMgS04.7H20、30g 40g CaC03、0.5g 0.6g 尿素，加蒸馏水至 1L，在自然 pH 值、110°C 130°C °C的条件下灭菌25min 35min。作为本专利技术的最佳实施方案:步骤c发酵培养过程中发酵培养基的制备方法为:35目沉香树干粉末煮沸30min，用纱布过滤，加入IOOg葡萄糖、0.35gKH2P04、0.15gMgS04.7H20、35g CaC03、0.55g尿素，加蒸馏水至1L，在自然pH值、121.5°C的条件下灭菌30mino已有研究证实黑曲霉是一种广泛存在于自然界的腐生真菌，黑曲霉具有强大的聚合物降解酶系，可产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶和葡萄糖氧化酶等超过30种胞外蛋白，赋予其在贫瘠生长条件下能够快速生长和发酵的能力，且保持旺盛的代谢活性而不易受到环境微生物的影响，在能够适应开放或封闭环境中快速生长和繁殖，黑曲霉菌在食品、啤酒与酿造、制药等诸多行业广泛应用。本专利技术采用的黑曲霉菌，可用于转化法生产优质沉香。本专利技术的有益效果是:本专利技术成功的从高品质野生沉香中分离筛选到一株黑霉菌Aspergillus niger An_53,将其 接种在健康沉香树中I个月成功在伤口附近转化合成沉香，将其发酵液或胞外酶浓缩液输入沉香树I个月能够实现整个沉香树干结香，而发酵液或胞外酶浓缩液也能够快速转化沉香树干木屑合成沉香油。本专利技术发酵培养分离于沉香中的黑霉菌An-53，并利用其分泌的胞外酶(如淀粉酶、纤维素酶和果胶酶等)转化木材中薄壁细胞储存的淀粉、多糖等营养物质合成沉香，具有广阔的应用前景。本专利技术方法简便且用途广泛，采用黑曲霉固化接种树体方法可生产沉香条用于燃香和入药，该方法操作简便、成本低廉、无需专业设备适合沉香种植户；黑曲霉发酵液或胞外酶浓缩液注入树体可生产大尺寸沉香块用于高档工艺品制作，该方法适合大面积种植沉香的基地或企业，能够实现大面积沉香转化合成沉香并能够大幅度提高沉香产量和等级；通过发酵法直接将沉香树干粉末转化合成优质沉香油并可用于生产香水，从而实现大规模工业化生产高价值沉香油。附图说明图1是本专利技术的生产流程图；图2为本专利技术野生沉香中分离的黑曲霉An-53菌落形态学特征图；图3为本专利技术中黑曲霉真菌PCR扩增鉴定电泳图；图4为本专利技术接种黑曲霉菌刺激生产高品质黑褐色沉香的结果图。具体实施例方式以下所述仅是本专利技术的优选实施方式，但不应理解为对本专利技术的限制。应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利技术的保护范围，以下结合附图对本专利技术作详细描述。如图1至图4所示，，沉香转化真菌菌株为黑曲霉(Aspergillus niger),其包括如下步骤:a、首先对黑曲霉菌种An_53CCTCCM2012304进行菌种分离、纯化和鉴定步骤:菌种分离:精密称取Ig高品质沉香样品,至于培养皿,用无菌蒸馏水冲洗3次，将样品转移至无菌研钵中研碎，加入9ml无菌水稀释，之后用同样的等浓度梯度进行稀释，配制10-1，10-2，10-3，10-4，10-5等5个浓度梯度，用无菌移液管吸取Iml缓缓注入筛选培养基上，分离筛选培养基的制备方法为:35目沉香树干粉末煮沸30min,纱布过滤,定容至IOOOmL,加入I %葡萄糖，1.5%琼脂，在pH为7.5、121.5°C的条件下灭菌30min，摇匀，密封置于28°C条件下暗培养，4d 5d后菌落长满整个平板。菌种纯化:根据初分菌落的形态特征，用接种针挑取各菌落的少量菌丝体，接种在事先准备好的筛选培养基上，菌丝体生长7d后，根据长出的各菌落特点进行筛选和纯化，如此反复，直至菌落的生长状态和形态特征表现一致时视为单一菌种的菌落。菌种保存:纯化后的病原菌，保存在含液体石蜡的PDA斜面试管中。从野生高品质沉香中分离纯化黑曲霉菌，并对分离出的黑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法，其特征在于：所述利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法包括如下步骤：a、首先对黑曲霉菌种An?53CCTCC?M2012304进行菌种分离、纯化和鉴定步骤，从野生高品质沉香中分离纯化黑曲霉菌，并对分离出的黑曲霉菌进行形态学鉴定；b、然后对黑曲霉进行培养，包括活化培养、种子液培养和发酵培养；c、对黑曲霉的发酵液经过过滤和浓缩步骤，制得黑曲霉胞外酶浓缩液；d、黑曲霉胞外酶转化合成优质沉香：固化菌株接种刺激造香，发酵液或胞外酶浓缩液注入沉香树转化生产沉香；发酵液或胞外酶浓缩液转化木屑合成沉香油。

【技术特征摘要】
2012.08.28 CN 201210316449.X1.一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法，其特征在于:所述利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法包括如下步骤: a、首先对黑曲霉菌种An-53CCTCCM2012304进行菌种分离、纯化和鉴定步骤，从野生高品质沉香中分离纯化黑曲霉菌，并对分离出的黑曲霉菌进行形态学鉴定； b、然后对黑曲霉进行培养，包括活化培养、种子液培养和发酵培养； C、对黑曲霉的发酵液经过过滤和浓缩步骤，制得黑曲霉胞外酶浓缩液； d、黑曲霉胞外酶转化合成优质沉香: 固化菌株接种刺激造香，发酵液或胞外酶浓缩液注入沉香树转化生产沉香；发酵液或胞外酶浓缩液转化木屑合成沉香油。2.根据权利要求1所述的一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法，其特征在于:所述步骤a菌种分离过程中菌种分离筛选培养基的制备方法为:35目沉香树干粉末煮沸25min 35min,纱布过滤,定容至IOOOmL,加入0,8% 1.2%葡萄糖，I % 2%琼脂,在pH为7 8、110°C 130°C 的条件下灭菌25min 35min。3.根据权利要求2所述的一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄志琴，
申请(专利权)人：黄志琴，
类型：发明
国别省市：