本发明专利技术涉及一种影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物的生测方法，包括以下步骤：取内腔容积在10至500mm3的细管，在细管正中间开一用来滴加蒸馏水和线虫液的小口，在细管的一侧放入一个产生活性挥发性代谢物质(VOCs)的微生物培养基小块，或者含有VOCs的样品溶液的介质（如滤纸、培养基、玻璃毛），标记为处理端；另一侧放入一个未接种微生物或不含活性挥发性代谢物质(VOCs)的培养基小块或介质，标记为对照端，再将细管两侧封口，用微量进样器从细管中间的小口处滴入线虫液，置于培养箱中培养。分别于10h，24h，36h后分离线虫，28℃下静置24h后镜检，统计分离到的线虫数并进行数据分析。本发明专利技术可方便地找出微量的甚至纳克量级的具有引诱活性的化合物。
Bioassay method for microbial volatile compounds affecting nematode orientation behavior
The invention relates to a tendency of microbial effects of nematode volatile compounds bioassay method comprises the following steps: Taking capillary lumen volume in 10 to 500mm3, in the center of a small tube for adding distilled water and nematode liquid, put in the tube side of a volatile substance metabolic activity (VOCs) the microbial culture medium or small, the sample solution containing VOCs medium (such as paper, medium, glass wool), marked as treatment end; the other side into a non inoculated microorganism or not containing active volatile metabolites (VOCs) of the medium small or medium, labeled as the control terminal, and then the spines on both sides seal with micro injector from the small tube at the middle liquid drops into the nematode, placed in the culture box. After 10h, 24h and 36h, the nematodes were isolated and examined by 24h at 28 DEG C, then the number of nematodes and the data were analyzed. The present invention is convenient to find a compound with a high activity and even a small number of ng.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物(VOCs)的生测方法，属生物测定
技术介绍
研究松材线虫的化学生态学，对了解松萎蔫病的致病机理及过程有着重要的意义。其中，生测手段必不可少。在快速检测昆虫触角对气味的反应方面，触角电位图(Electroantennogram,EAG)是非常重要的生物测定方法(赵新成等，2004)。气相色谱与触角电位(GC-EAD)连用技术可以通过昆虫触角的化学感器对化合物进行识别，检测其中的活性组分。受限于目前的手段，线虫的信息素的研究手段无法像昆虫的一样，不能直接用仪器检测到线虫对活性组分的神经电脉冲信号。因此只有将待分析的VOCs经GC-MS分析和鉴定出所有的组分的结构，购买所有有可能的化合物或进行合成，再对线虫进行生测(Zhao等，2007 ;Kaplan 等，2008 ;Niu 等，2010)。常用松材线虫的生测手段一般采用琼脂平板生测法，以水琼脂平板或木段等为基质，来研究松材线虫的移行。具体的方法如下:在培养皿中倒入2%琼脂水液，待琼脂凝固后，用记号笔在培养皿背面划线，以平板中心为原点，将平板均匀的等分为四个象限。在第一或第三象限放入处理，一般为真菌小块或样品溶液等；在第二或第四象限放入对照，一般为培养基小块或溶剂等。然后在平板中心滴入线虫液，一段时间后检测线虫的移行情况。Mamiya(Mamiya, 2006)用水琼脂平板为生测材料,研究了木材腐生真菌的活菌丝对松材线虫的作用。赵莉蔺(Zhao等，2007)以0.8%琼脂平板为基质，对马尾松和松褐天牛的挥发物对线虫的吸引作用进行了研究。龙瑞敏(龙瑞敏，2007)分别以灭菌的淡水沙和水琼脂平板为基质，研究了松材线虫的移行。谈家金(谈家金等，2009)在水琼脂平板和木段上研究了松树挥发物对松材线虫的吸引作用。上述琼脂平板生测法有两大不足，首先，它对生测样品的量需要量很大，以形成较高浓度梯度，被松材线虫感觉到；其次，采用了线虫在琼脂表面运动的方法进行，由于不同线虫的在自然界生境不同，存活的介质也不同，琼脂表面并不完全适合线虫的运动，特别是绝大多数线虫是在介质中运动，而不是在介质表面运动。因此这些方法影响线虫的运动，继而影响生测的灵敏度和准确性。Ishikawa (Ishikawa M, Shuto Y, Watanabe H.β -Myrcene, a PotentAttractant Component of Pine Wood for the Pine Wood Nematode, Bursaphelenchusxylophilus (Pesticide Chemistry).Agricultural and biological chemistry, 1986，50 (7):1863-1866.)建立了一种生测方法，用于检测供试化合物(5 mg)的挥发物对松材线虫的吸引作用。他使用的生测装置是T型玻璃管，内含9 ml 1.5 %的琼脂。该装置的空腔体约为 π X r2 X h = 3.14 X (5 mm) 2 X 200 mm = 15700 mm3。且T 型管顶部有个虹吸管，用于向外抽气。使用该方法，它对管内的样品的浓度要求很高，即需要的所测化合物的量很大(毫克mg数量级)。使用该生测方法无法检测到GC分离得到的对松材线虫有生物活性的微量挥发物(纳克ng数量级的化合物)。 张田园((张田园，牛秋红，应树松，刘艳，王敏，王珍珍，过雨晴.细菌Bacillus sp.NS-3和灰葡萄孢对松材线虫的诱引.南阳师范学院学报，2011:47-50.)采用“水琼脂平板移行法”和“玻管法”，研究了松材线虫拮抗细菌Bacillussp.NS-3和灰葡萄孢引诱线虫的能力。其方法为改良的玻管法,参考自Ishikawa的方法。采用玻管并在其上加装了虹吸管，对外抽气。方法中玻管内的空腔体积为η X r2 X h =3.14 X (45 mm)2 X 7.5 mm = 47688.75 mm3，该方法同样对生测样品的量需要量很大，有着很高的要求。此外，目前的生测方法常结合气相色谱质谱(GC-MS)联用仪进行，将收集的VOCs进行气相色谱质谱(GC-MS)联用仪测定后，将鉴定出来的所有物质进行合成或购买已知的化合物，然后对松材线虫进行生测，最终确定活性组分的结构和含量(Zhao等，2007 ；Kaplan等，2008 ;Niu等，2010)。这种方法不仅复杂,而且很可能购买不到所有的化合物，使得不能鉴定出所有的具有生物活性的化合物。综上所述，现有生测方法对活性挥发性代谢物质的浓度有明显的限制，它要求活性挥发性代谢物质(VOCs)有一 定的量，以形成较高浓度梯度，被松材线虫感觉到。现有采用加装虹吸管的玻管的生测方法，对管内的样品的浓度要求很高，即需要的所测化合物的量很大(毫克mg数量级)。对于活性挥发性代谢物质(VOCs)微量的样品，或无法测出，或虽然能够检测到一定的生物活性，但统计处理结果差异不显著(p>0.05)。使用现有生测方法无法检测到由GC分离而直接得到的对松材线虫有生物活性的微量挥发物(纳克ng数量级的化合物)。需要加以改进。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种能测定出微量的影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物(VOCs)的方法。本专利技术的技术解决方案如下: 一种影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物(VOCs)的生测方法，包括以下步骤:取内腔容积在10至500 mm3的细管，在细管正中间开一用来滴加蒸馏水和线虫液的小口，在细管的一侧放入一个有产生活性挥发性代谢物质(VOCs)微生物的培养基小块，或者含有VOCs的样品溶液的介质，标记为处理端；另一侧放入一个未接种微生物或不含活性挥发性代谢物质(VOCs)的培养基小块，标记为对照端，再将细管两侧封口，用微量进样器从细管中间的小口处滴入线虫液，置于培养箱中培养。分别于10 h，24 h，36 h后分离线虫，28°C下静置24 h后镜检，统计分离到的线虫数并进行数据的统计分析。上述细管可采用玻璃、金属、无挥发物的塑料等材料制成的细管，优选采用透明硅胶管。本专利技术的优点在于:本专利技术所采用的“硅胶管法”更加灵敏，很小的空腔体积和封闭的环境确保“硅胶管法”对于微量的挥发物有着非常高的检测灵敏度。进一步的技术解决方案为:在管内居中放置适合于线虫运动的介质，以硅胶管中间的小口处为中心居中放置于硅胶管中，在硅胶管中间的小口处缓慢注入蒸馏水，使介质刚好全部湿润。在过去已有的生测方法中绝大多数采用了线虫在琼脂表面运动的方法进行，由于不同线虫的在自然界生境不同，存活的介质也不同，琼脂表面并不完全适合线虫的运动，特别是绝大多数线虫是在介质中运动，而不是在介质表面运动。因此这些方法影响线虫的运动，继而影响生测的灵敏度和准确性。本专利技术采取了对特定线虫使用适合于线虫运动的介质，使得线虫在适合的介质中运动，提高了生测的灵敏度和准确性。再进一步的技术解决方案为:所述介质为经灭活的线虫实际生活环境用土壤、木屑，也可以为棉线、滤纸、玻璃毛，优选采用直径为透明硅胶管内径的滤纸棒。上述介质是适合于线虫运动的介质，滤纸棒易取得和制作。再进一步的技术解决方案为:所述透明硅胶管的内径为1-3 mm本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物的生测方法，包括以下步骤：取内腔容积在10至500?mm3的细管，在细管正中间开一用来滴加蒸馏水和线虫液的小口，在细管的一侧放入一个有产生活性挥发性代谢物质微生物的培养基小块，或者含有活性挥发性代谢物质的样品溶液的介质，标记为处理端；另一侧放入一个未接种微生物或不含活性挥发性代谢物质的培养基小块，标记为对照端，再将细管两侧封口，用微量进样器从细管中间的小口处滴入线虫液，置于培养箱中培养，分别于10?h，24?h，36?h后分离线虫，28℃下静置24?h后镜检，统计分离到的线虫数并进行数据的统计分析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵博光，叶兼菱，林峰，王华光，刘秀华，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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