本发明专利技术提供了一种七通道黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法及应用，属于食品安全分析、纳米功能材料和生物传感技术领域。所述传感器集成7个工作电极，其制作方案是：以塑料为基板，将导电油墨、掺杂复合材料的导电油墨、银浆、绝缘浆通过丝印机印刷到基板上，分别制成辅助电极、工作电极、参比电极以及绝缘层。复合材料由1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸离子液体和聚苯胺构成，采用钯纳米粒子-壳聚糖复合材料修饰工作电极。实现了黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2以及总黄曲霉毒素的同时测定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品安全分析、纳米功能材料与生物传感
，具体涉及一种七通道黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法及应用。
技术介绍
黄曲霉毒素(Aflatoxins )是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，特曲霉也能产生黄曲霉毒素，但产量较少。产生的黄曲霉毒素主要有B1、B2、Gl、G2以及另外两种代谢产物Ml、M2。其中Ml和M2是从牛奶中分离出来的。B1、B2、G1、G2、M1和M2在分子结构上十分接近。目前发现的黄曲霉毒素有十几种。众所周知的“黄曲霉毒素Ml”主要出现在各种奶中。B1、B2、G1和G2是经常出现在农产品中的黄曲霉毒素的代表，毒性最强的是BI。BI和B2被奶牛吃后，分别有一小部分会转化为Ml和M2进入奶中，这就是牛奶中黄曲霉毒素的来源。黄曲霉毒素在农产品中几乎无法避免,农业生产中，黄曲霉毒素超标的玉米并不少见。倘若全部销毁，将会造成很大的损失，世界各国，通过设定一个“限量标准”加以控制。黄曲霉毒素BI的半数致死量为0.36 mg/kg体重,属特剧毒的毒物范围。它引起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎、肝硬化和肝坏死等。临床表现有胃部不适、食欲减退、恶心呕吐、腹胀及肝区触痛等，严重者 出现水肿昏迷，甚至抽搐而死。黄曲霉毒素是目前发现的最强的致癌物质，其致癌力比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍，主要诱使动物发生肝癌也能诱发胃癌、肾癌、直肠癌及乳腺，卵巢小肠等部位的癌症。1995年，世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15Pg/kg ;美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量(指B1+B2+G1+G2的总量)不能超过15Pg/kg ;人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5Pg/kg，其他动物饲料中的含量不能超过30(g/kg。而欧盟国家规定更加严格，花生和坚果及其加工产品、所有谷类食品及其加工产品中黄曲霉毒素BI限量为2.0Pg/kg ;原奶、热处理奶及加工奶产品中Ml限量为0.05^g/kg ;婴儿食品(包括婴幼儿奶)中Ml限量为0.025Pg/kg。目前国内绝大多数检测机构都在使用薄膜层析法和液相色谱法进行黄曲霉毒素的检测。由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点，已不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学和分子生物学的不断发展，建立灵敏、特异、快速地检测黄曲霉毒素的方法迫在眉睫。所用原料均可以在化学试剂公司或生物制药公司购买。本专利技术利用电化学技术，提高方法的灵敏度；结合免疫技术，增强传感器的选择性；不需要对样品进行预处理，节省了检测时间，降低了检测成本；采用多通道丝网印刷电极实现了多种黄曲霉毒素的同时检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于避免传统检测方法的仪器设备复杂、操作过程繁琐、检测人员要求高、检测成本昂贵等缺点，提供了一种灵敏度高、特异性强、重现性好、操作简便快速的七通道黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法及应用。为了实现上述目的，本专利技术通过以下措施来实现的。技术方案，包括以下步骤。1.一种七通道黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (I)在塑料基板上，用掺杂复合材料的导电油墨印刷7个工作电极，用导电油墨印刷I个辅助电极；用银浆印刷I个参比电极、电极触点以及连接导线；用绝缘浆涂覆除各电极和电极触点外的导线区域，形成绝缘层；在电极区域形成一个圆形的电解池凹槽，制得七通道丝网印刷电极。所述复合材料由1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸离子液体(BF4)和聚苯胺组成，其质量比为(10 20):1。所述复合材料与导电油墨的质量比为1: (10 15)。(2)在所制备的七通道丝网印刷电极的7个工作电极的表面分别涂覆一层钯纳米粒子-壳聚糖复合材料，钯纳米粒子是由硼氢化钠还原氯钯酸铵制得的；所述的钯纳米粒子-壳聚糖复合材料是将Img钯纳米粒子分散于质量分数为1%的壳聚糖乙酸溶液中。(3)在步骤(2)得到的工作电极b的表面上滴涂5 IOPL黄曲霉毒素BI抗体、工作电极c的表面上滴涂5 IOPL黄曲霉毒素Β2抗体、工作电极d的表面上滴涂5 ΙΟμ 黄曲霉毒素Gl抗体、工作电极e的表面上滴涂5 IOPL黄曲霉毒素G2抗体、工作电极f的表面上滴涂5 IOPL黄曲霉毒素Ml抗体、工作电极g的表面上滴涂5 10μ 黄曲霉毒素M2抗体和工作电极h的表面上滴涂5 10μ 总黄曲霉毒素抗体；润湿状态下放置I 3h ;所述抗体浓度为5 10 Pg/mL。(4)在步骤(3)得到的7个工作电极表面分别滴加5PL，质量分数为1%的牛血清白蛋白，待干燥后，用PH为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗干净，即制得七通道黄曲霉毒素免疫传感器。2.所述的制备的一种七通道黄曲霉毒素免疫传感器，用于6种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素的检测，步骤如下: (I)将6种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素的标准溶液分别滴涂到上述方法制备的七通道黄曲霉毒素免疫传感器对应的工作电极表面上，孵化I 3 h，然后用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗干净，得到修饰好的工作电极。(2)将参比电极、辅助电极和工作电极连接在多通道电化学工作站上,在电解槽中加入5 mmol/L的铁氰化钾溶液，通过方波伏安法检测所述修饰好的工作电极的电流响应。(3)根据所得电流响应与6种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素的标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线。(4)用待测样品代替6种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素的标准溶液，按照所述6种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素工作曲线的绘制方法进行检测，其检测结果对照所绘制的6种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素工作曲线，计算出样品中6种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素的含量。所述七通道黄曲霉毒素免疫传感器实现了黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素Ml、黄曲霉毒素M2以及总黄曲霉毒素的同时测定。所述的七通道黄曲霉毒素免疫传感器，所用原料均可以在化学试剂公司或生物制药公司购买。本专利技术具备以下优势。(I) 本专利技术快速、准确，不需前处理，可用于复杂样品中的多种黄曲霉毒素的同时检测。(2)本专利技术采用的聚苯胺、离子液体、钯纳米粒子可显著提高电化学信号，从而提高了本专利技术传感器的灵敏度。(3)本专利技术印刷电极制备简单、成本低、便于携带、样品消耗少，易于微型化和集成化，应用范围广。( 4)本专利技术与其它的丝网印刷电极传感器相比，可以一次性同时检测复杂样品中6种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素，具有良好的准确性和精密度，显著提高了检测效率。附图说明图1是丝网印刷电极的示意图。a为塑料基板，b h为工作电极，i为辅助电极，j为参比电极，k为电极触点，I为绝缘层，m为电解池凹槽。具体实施例方式下面结合附图和实施例进一步说明本专利技术。实施例一 本专利技术所述的一种七通道黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法，结合图1，步骤如下。第一步，清洗电极基板a，干燥后在基板a上用掺杂质量比为20:1 BF4和聚苯胺的复合材料的导电油墨印刷7个工作电极b h，用导电油墨印刷I个辅助电极i，常温干燥，其中复合材料与导电油墨的质量比为1: 10。第二步，在塑料基板a上印刷银浆，用银浆印刷参比电极j和电极触点k之间连接的导线，并将各电极与相应触点用银浆连接起来，常温干燥。第三步，在塑料基板a上用绝缘浆涂覆除各电极及电极触点外的导线区域，形成绝缘层1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种七通道黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在塑料基板上，用掺杂复合材料的导电油墨印刷7个工作电极；用导电油墨印刷1个辅助电极；用银浆印刷1个参比电极、电极触点以及连接导线；用绝缘浆涂覆除各电极和电极触点外的导线区域，形成绝缘层；在电极区域形成一个圆形的电解池凹槽；（2）在所制备的七通道丝网印刷电极的7个工作电极的表面分别涂覆一层钯纳米粒子?壳聚糖复合材料；（3）在步骤（2）得到的工作电极b的表面上滴涂5?~?10μL黄曲霉毒素B1抗体、工作电极c的表面上滴涂5?~?10μL黄曲霉毒素B2抗体、工作电极d的表面上滴涂5?~?10μL黄曲霉毒素G1抗体、工作电极e的表面上滴涂5?~?10μL黄曲霉毒素G2抗体、工作电极f的表面上滴涂5?~?10μL黄曲霉毒素M1抗体、工作电极g的表面上滴涂5?~?10μL黄曲霉毒素M2抗体和工作电极h的表面上滴涂5?~?10μL总黄曲霉毒素抗体；润湿状态下放置1?~3?h；所述抗体浓度为5?~?10?μg/mL；（4）在步骤（3）得到的7个工作电极表面分别滴加5μL牛血清白蛋白，待干燥后，用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗干净，即制得七通道黄曲霉毒素免疫传感器。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏琴，杜斌，王欢，于海琴，张勇，吴丹，李贺，马洪敏，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。