一种牦牛精子体外获能的方法技术

本发明专利技术公开了一种牦牛精子体外获能的方法，主要包括：牦牛冷冻精液解冻方法、精子体外获能液及获能方法、精子体外受精液及获能效果评估方法。并提供了牦牛精子体外获能的具体条件，确保牦牛精子体外获能的质量和效率。本发明专利技术技术与方法全面，操作方便，测定结果准确，可完全用于牦牛精子体外获能或胚胎体外生产，能够有效提高牦牛的繁殖效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属牦牛繁殖领域，涉及牦牛胚胎生物技术，具体涉及。
技术介绍
牦牛是分布于青藏高原及毗邻地区特有的牛种资源。牦牛的繁殖具有明显的季节性，牦牛发情具有普通牛的一般特征，但不如普通牛种明显。但特殊的自然生态环境条件，使牦牛形成了晚熟、繁殖力低的生态生理特性。随着现代生物技术的发展，胚胎生物技术逐步应用于牦牛科学研究，但由于重复性差、结果不稳定，致使牦牛胚胎生物技术在牦牛生产上还未有效开展。尤其是牦牛体外受精技术，普遍存在的问题是受精卵的卵裂率和囊胚体外发育率结果不稳定，体外受精的总成功率偏低。而牦牛精子的体外获能是体外受精技术的关键环节，因此极有必要针对牦牛生态生理特性与繁殖特征，研制出，完善牦牛胚胎体外生产技术方案，加速生物技术在牦牛繁育中的应用，从而提高牦牛繁殖效率，全面发挥优良牦牛的繁殖特性。
技术实现思路
为了降低精子解冻过程中的损伤，提高有效获能精子数，解决上述技术问题，本专利技术针对牦牛冷冻精液与精子特点，提供一种简便、合理的牦牛精子体外获能的方法，结果准确，易于操作，可用于牦牛胚胎体外生产及相关科学研究中，并为牦牛胚胎生物技术发展提供参考。其技术方案如下: ，包括如下步骤:(I)从液氮罐中取出冷冻精液细管，空气中停留6s，然后投入37°C 38°C的恒温水浴锅中，待其融化1/2时取出；(2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分，再迅速用酒精棉球搽拭一次，置于超净工作台内使其完全溶解；(3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理；(4)将步骤(3)处理的精子，移入受精液中，精卵共培养，进行体外受精，检测精子获能效果；(5)受精16 18h后，用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3 5遍，转移至早期胚胎培养液中，48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。进一步优选，所述步骤(3)上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入ImL精子获能液，混匀后分装于4个小塑料离心管中，38.50C CO2培养箱上浮lh，然后将4个离心管中的上清液小心收集到I个IOmL离心管中，约0.6 0.8mL, 700 800g离心洗漆2次,8 IOmin/次；洗漆后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成2X IO7 4X IO7个/mL, 38.5°C预孵获能处理25 30min，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、1.0mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由IOOmM氯化钠、3.1mM氯化钾、2.1mM氯化钙、04mM氯化镁、0.29mM磷酸二氢钠、21.6mM乳酸钠、IOmM H印es、25mM碳酸氢钠及抗生素组成；所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素；所述CO2培养箱中:C02含量5%、温度38.5°C、湿度饱和。进一步优选，所述步骤(4)体外受精步骤为:将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤3 5遍，放入预孵2h的50 μ L受精液微滴中，每滴15 20枚；每微滴受精液加入25 50 μ L获能后的精子悬液，使精子的最终浓度为I X IO6个/mL，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、0.09mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由114mM氯化钠、3.2mM氯化钾、2.0mM氯化钙、0.5mM氯化镁、0.4mM磷酸二氢钠、25mM碳酸氢钠、IOmM乳酸钠及抗生素组成；所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；所述CO2培养箱中:C02含量5%、温度38.5 °C、湿度饱和。进一步优选，所述步骤(5)中，早期胚胎培养液为基础液M199添加10%胎牛血清及抗生素；所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；培养条件为CO2含量5%、温度38.5 °C、湿度饱和。本专利技术的有益效果:本专利技术解冻的牦牛冷冻精液精子活力> 0.35，获能后精子活力> 0.7，受精用精子密度I X IO6 2X IO6个/mL，受精用精子畸形率< 15 %，成熟卵母细胞受精后卵裂率^ 60%。本专利技术用于牦牛冷冻精液精子体外获能技术与方法全面，操作方便，测定结果准确，易于牦牛胚胎体外生产使用。本专利技术用于牦牛冷冻精液精子体外获能技术与方法全面，操作方便，测定结果准确，易于牦牛胚胎体外生产使用。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。实施例1解冻I支牦牛冷冻精液进行体外获能处理。(I)从液氮罐中取出I支牦牛冷冻精液细管，空气中停留6s，然后投入37°C 38°C的恒温水浴锅中，待其融化1/2时取出。(2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分，再迅速用酒精棉球搽拭一次，置于超净工作台内使其完全溶解。(3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理；上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入ImL精子获能液，混匀后分装于4个小塑料离心管中，38.5°C CO2培养箱上浮lh，然后将4个离心管中的上清液小心收集到I个IOmL离心管中，约0.6 0.8mL，700g离心洗涤2次，IOmin/次；洗漆后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成2X IO7 4X IO7个/mL，38.5°C预孵获能处理25min，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mL BSA、1.0mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由IOOmM氯化钠、3.1mM氯化钾、2.1mM氯化钙、0.4mM氯化镁、0.29mM磷酸二氢钠、21.6mM乳酸钠、IOmM H印es、25mM碳酸氢钠及抗生素组成；所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素；所述CO2培养箱中:C02含量5%、温度38.5°C、湿度饱和。(4)将步骤(3)处理的精子，移入受精液中，精卵共培养，进行体外受精，检测精子获能效果；体外受精步骤为:将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤3 5遍，放入预孵2h的50 μ L受:精液微滴中，每滴20枚；每微滴受:精液加入50 μ L获能后的精子悬液，使精子的最终浓度力I X IO6个/mL，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、0.09mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由114mM氯化钠、3.2mM氯化钾、2.0mM氯化钙、0.5mM氯化镁、0.4mM磷酸二氢钠、25mM碳酸氢钠、IOmM乳酸钠及抗生素组成；所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；所述CO2培养箱中:C02含量5%、温度38.5°C、湿度饱和。(5)受精18h后，用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3 5遍，转移至早期胚胎培养液中，48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。早期胚胎培养液为基础液M199添加10%胎牛血清及抗生素；所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；培养条件为CO2含量5%、温度38.5 °C、湿度饱和。 实施例2解冻2支牦牛冷冻精液进行体外获能处理。(I)从液氮罐中取出2支牦牛冷冻精液细管，空气中停留6s，然后投入37°C 38°C的恒温水浴锅中，待其融化1/2时取出。(2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分，再迅速用酒精棉球搽拭一次，置于超净工作台内使其完全溶解。(3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理；上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入1.5mL精子获能液，混匀后分装于6个小塑料离心管中，38.5°C CO2培养箱上浮lh，然后将6个离心管中的上清液小心收集到I个15mL离心管中，约0.8 1.2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牦牛精子体外获能的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从液氮罐中取出冷冻精液细管，空气中停留6s，然后投入37℃～38℃的恒温水浴锅中，待其融化1/2时取出；(2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分，再迅速用酒精棉球搽拭一次，置于超净工作台内使其完全溶解；(3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理；(4)将步骤(3)处理的精子，移入受精液中，精卵共培养，进行体外授精，检测精子获能效果；(5)受精16～18h后，用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3～5遍，转移至早期胚胎培养液中，48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。

【技术特征摘要】
1.一种牦牛精子体外获能的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)从液氮罐中取出冷冻精液细管，空气中停留6S，然后投入37°C 38°C的恒温水浴锅中，待其融化1/2时取出； (2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分，再迅速用酒精棉球搽拭一次，置于超净工作台内使其完全溶解； (3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理； (4)将步骤(3)处理的精子，移入受精液中，精卵共培养，进行体外授精，检测精子获能效果； (5)受精16 18h后，用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3 5遍，转移至早期胚胎培养液中，48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入ImL精子获能液，混匀后分装于4个小塑料离心管中，38.5°C CO2培养箱上浮lh，然后将4个离心管中的上清液小心收集到I个IOmL离心管中，约0.6 0.8mL, 700 800g离心洗洚2次,8 IOmin/次；洗漆后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成2X IO7 4X IO7个/mL，38.5°C预孵获能处理25 30min，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mL BSA、1.0mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由IOOmM氯化钠、3....

【专利技术属性】
技术研发人员：郭宪，丁学智，阎萍，梁春年，王宏博，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，
类型：发明
国别省市：