测量样本中激发态寿命的方法技术

本发明专利技术公开了一种测量样本中激发态寿命的方法，特别是测量荧光寿命的方法，以及执行这种方法的设备。首先，生成激发脉冲并用该激发脉冲照亮样本区域。随后，生成表示激发脉冲的功率-时间曲线的第一数字数据序列，并且根据第一数字数据序列确定第一开关时刻。此外，利用检测器检测从样本区域发出的检测光，生成表示检测光的功率-时间曲线的第二数字数据序列，并且根据第二数字数据序列确定第二开关时刻。最后，计算第一和第二开关时刻之间的时间差。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，具体地，涉及测量荧光寿命的方法以及用于实施这种方法的设备。本专利技术还涉及测量样本中激发态寿命的设备，具体地，涉及测量荧光寿命的设备，该设备包括用于产生激发脉冲以利用该激发脉冲照亮样本区域的光源以及用于检测从样本区域发出的检测光的检测器。
技术介绍
通过分析利用一种或多种荧光染料标记的样本的激发态寿命，可获得与样本性质有关的重要信息。尤其是当使用多种荧光染料时，可以通过利用荧光寿命成像显微仪(FLIM)获得与被分析的样本区域有关的信息(例如与其成分和环境有关的信息)。在细胞生物学中，例如，可以通过测量荧光染料的寿命间接地推断出样本区域中的钙离子浓度。现有多种方法来测量荧光染料的激发态寿命。一些方法在1999年KluwerAcademic/Plenum 出版的由 Joseph R.Lakowicz 所著的教科书 “Principles ofFluorescence Spectroscopy”第二版中有所描述。例如,可以调制激发光随着时间的功率，从而可以通过发出光的相位延迟推断出激发态的寿命。还可以利用短光脉冲激发荧光染料，从而可以电子地测量发射脉冲的时间延迟。举例来说，德国专利公开文献DE 102004017956A1描述了一种分析样本中激发态的寿命的显微镜，其包括至少一个用于产生激发光的光源以及至少一个用于接收从样本发出的检测光的检测器。显微镜的特征在于:光源包括发出脉冲激发光的半导体激光器以及调整设备，调整设备用于将脉冲重复频率调整至样本的特定的寿命特性。具体地，数据分析所需的电子设备是可商购的，其通常以PC插卡的形式提供。然而，除了高成本之外，这样的时间测量卡具有死区时间特别长的缺点，从而，在样本激发之后，其仅能够检测第一个检测脉冲(第一个检测光子)的到达然后在很长的一段时间内处于“盲”状态。最终，对于用户来说，包含在从样本发出的检测光中的信息的很大一部分仍然是隐藏的。此外，不可能对激发脉冲实现高重复频率，因此，也不可能在一个测量周期内进行频繁地测量。实际可实现的测量率远低于可商购的脉冲激光器的一般重复频率。出于该原因，举例来说，需要十分长的时间才能收集足够的数据以生成FLIM影像。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目的在于提供一种可能在较短的时间内获得更精确测量结果的方法。该目的是通过包括下述步骤的方法来实现的:a.生成激发脉冲并用该激发脉冲照亮样本区域，b.生成表示激发脉冲的功率-时间曲线的第一数字数据序列，c.根据第一数字数据序列确定第一开关时刻，d.利用检测器检测从样本区域发出的检测光，e.生成表示检测光的功率-时间曲线的第二数字数据序列，f.根据第二数字数据序列确定第二开关时刻，及g.计算第一和第二开关时刻之间的时间差。本专利技术的另一目的是提供一种可能在较短的时间内获得更精确测量结果的设备。该目的是通过上述类型的设备来实现的，该设备包括控制装置，该控制装置:a.生成表示激发脉冲的功率-时间曲线的第一数字数据序列，b.根据第一数字数据序列确定第一开关时刻，c.生成表示检测光的功率-时间曲线的第二数字数据序列，d.根据第二数字数据序列确定第二开关时刻，e.计算第一和第二开关时刻之间的时间差。根据本专利技术，尤其发现:仅当信息处理控制装置也能够检测这些发生在第一光子到达之后的但仍属于同一激发脉冲的光子事件时，可以获得除第一光子的到达时间之外的额外信息。还发现，这可以通过将模拟测量信号立即转换成数字序列而实现。具体地，本专利技术有利地使得能够以80MHz及以上的重复频率(对应于可商购的脉冲激光器的频率)循环地重复测量。此外，可以获得更精确的与样本的寿命特点有关的信息(具体的由于高数据处理速度)，不仅在任意一个时刻中检测了第一光子的到达时间，还检测了所有光子事件，只要有足够的激发功率。在方法的一种具体实施方式中，激发脉冲源自主光脉冲，主光脉冲的一部分被传送到激发检测器，激发检测器生成第一模拟电信号，第一模拟电信号的幅度-时间曲线取决于主光脉冲的该部分的功率的时间曲线，并且，为了生成第一数字数据序列，第一模拟电信号具体地以预定和/或可预定的第一时隙在时间上采样。具体地，光源可生成主光束，该主光束被光束分离器分成包括激发脉冲的激发束以及测量束，激发检测器可接收测量束并生成第一模拟电信号，第一模拟电信号的幅度-时间曲线取决于测量束的功率的时间曲线，并且，为了生成第一数字数据序列，控制装置具体地以预定和/或可预定的第一时隙在时间上对第一模拟电信号进行采样。举例来说，可以通过从标准化电信号(具体地，二进制数字)生成第一数据序列而实现第一数据序列的快速生成，生成的方式如下:当取样的幅度低于定义的和/或可定义的第一激发阈值时，生成较低的标准化信号(例如“0”)，或者当取样的幅度高于定义的和/或可定义的第二激发阈值时，生成不同于较低标准化信号的较高的标准化信号(例如“ I”)。有利地，检测器可生成第二模拟电信号，第二模拟电信号的幅度-时间曲线取决于检测光的功率的时间曲线，并且，为了生成第二数字数据序列，控制装置具体地以预定和/或可预定的第二时隙在时间上对第二模拟电信号进行采样。类似于第一数据序列，可以从标准化电信号(具体地，二进制数字)生成第二数据序列，生成的方式如下:当取样的幅度低于定义的和/或可定义的第一激发阈值时，生成较低的标准化信号，或者当取样的幅度高于定义的和/或可定义的第二激发阈值时，生成不同于较低标准化信号的较高的标准化信号。为了能够最大程度上检测到所有的光子事件，在有利的实施方式中，为了生成数据序列，具体地由控制装置以远高于重复频率的采样频率对第一和/或第二模拟电信号进行采样。具体地，以比重复频率高大于50倍，具体地高大于100倍的采样频率对第一和/或第二模拟电信号进行采样。在一种特别有利的实施方式中，以比重复频率高大约125倍的米样频率对第一和/或第二模拟电信号进行米样。在一种具体实施方式中，以IOGHz的采样频率对第一和/或第二模拟电信号进行采样，而重复频率为80MHz。在一种具体实施方式中，为了进一步增加时间分辨率，重复地对第一模拟电信号进行采样。具体地，可以重复地对第一模拟电信号进行采样，但带有比时隙短的时间偏移量，具体地是连续可调的时间偏移量。在一种提供特别精确结果的特别有利的实施方式中，对第一模拟电信号采样η次，但带有对应于时隙的第η个系数的时间偏移量。例如，在双采样的情况下，提供的时间偏移量可以相应地是时隙的持续时间的一半。优选地，随后将多次采样的采样结果在数学上相结合，具体地相互交错，从而分别产生第一数据序列和第二数据序列。具体地，通过多次采样和数据上的结合，可以产生包含η倍更多数据的数据序列，并且，与通过对单一测量期间的单一采样相比，具有明显更高的信息内容。举例来说，当使用包括比较器和/或恒定系数鉴频器的第一采样装置时，可以更快且更可靠地生成第一数字数据序列。具体地，这使得可能毫无压力地实现数十Gbits (例如，28Gbits)范围内的采样率。这同样适于于第二数字数据序列的生成，其有利地利用第二采样装置进行，该第二采样装置也包括比较器和/或恒定系数鉴频器。采样率可以相同，但并非必须相同。而且，取决于具体的应用，用于生成第一数字数据序列的的采样率可以不同于用于生成第二数本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测量样本中激发态寿命的方法，特别是测量荧光寿命的方法，包括下述步骤：a.生成激发脉冲并用该激发脉冲照亮样本区域，b.生成表示激发脉冲的功率‑时间曲线的第一数字数据序列，c.根据第一数字数据序列确定第一开关时刻，d.利用检测器检测从样本区域发出的检测光，e.生成表示检测光的功率‑时间曲线的第二数字数据序列，f.根据第二数字数据序列确定第二开关时刻，及g.计算第一和第二开关时刻之间的时间差。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：B·威兹高斯盖，
申请(专利权)人：徕卡显微系统复合显微镜有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE