本发明专利技术属于光学显微成像及光谱测量技术领域，涉及一种高空间分辨激光差动共焦图谱成像方法与装置。本发明专利技术的核心思想是融合差动共焦探测和光谱探测技术，并利用二向色分光系统(13)对瑞利光和拉曼散射光进行无损分离，其中，拉曼散射光进行光谱探测，瑞利光进行几何位置探测，利用差动共焦曲线(43)过零点与焦点位置精确对应这一特性，通过过零点触发来精确捕获激发光斑焦点位置的光谱信息，实现高空间分辨的光谱探测，构成一种可实现样品微区高空间分辨光谱探测的方法和装置。本发明专利技术具有定位准确，高空间分辨，光谱探测灵敏度高和测量聚焦光斑尺寸可控等优点，在生物医学、法庭取证等领域有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于光学显微成像及光谱测量
，涉及一种激光差动共焦图谱显微成像方法与装置，可用于各类样品的三维形貌重构及微区光谱探测。
技术介绍
1990年G.J.Puppels等在Nature期刊报道其专利技术的将拉曼光谱探测技术与激光共焦显微技术结合的激光共焦拉曼光谱显微技术，是拉曼技术的一次革命性突破。该技术既继承了共焦显微术的高分辨层析成像特征，又可以对样品进行光谱分析，因此可以实现对样品微区光谱的高分辨层析探测。此显著优点使激光共焦拉曼光谱显微技术在光谱测试领域独树一帜，并且迅速发展为一种极其重要的样品结构与成分分析的重要手段，使之广泛应用于化学、生物学、医学、物理学、地质学、法庭取证、刑侦学等学科的前沿基础研究中。目前，典型的激光共焦拉曼光谱探测仪的原理如图2所示，激光沿光路依次经过第一聚光镜、第一针孔、第八聚光镜、第一分光系统、四分之一波片、物镜后，聚焦在被测样品上，激发出载有样品光谱特性的拉曼散射光；移动被测样品，使对应被测样品不同区域的拉曼散射光再次通过四分之一波片并被第一分光系统反射，经过第四聚光镜、第四针孔、第五聚光镜后聚焦进入第一光谱仪进行光谱探测。现代科技的快速发展对微区光谱探测能力及空间分辨探测能力提出了更高的要求，若要提高空间分辨力，必须对系统进行精确定焦。在光学探测系统中，当测量聚焦光斑位于焦点时其尺寸最小，激发光强最强，因此为了获得高空间分辨力，必须能够捕获到激发光强最强处的光谱，从而获得其最佳空间分辨力和最优的光谱探测能力。如图1所示，现有的共焦显微技术在激光激发焦点O附近的BB'区域内，均能激发出样品的拉曼光谱，并能被针孔后的光谱探测系统探测。因而共焦拉曼光谱显微技术的实际探测位置往往处于共焦曲线中离焦的BA和A' B'区，从而导致实际探测的“微区”远大于测量光束焦点O处光斑尺寸，同时，应用拉曼光谱进行共焦定位信噪比较低，并且由于针孔的遮挡作用会进一步降低拉曼光谱的能量，而扩大针孔尺寸提高光谱通过率则会增加共焦轴向定位曲线的半高宽，降低其定位精度，而现有共焦拉曼系统中的共焦针孔尺寸通常在150 μ m 200 μ m之间，所用针孔尺寸相对较大，亦不能很好的起到定焦作用。上述原因限制了共焦拉曼光谱显微系统探测微区光谱的能力，制约了其在更精细微区光谱测试与分析场合中的应用，因而提高系统的定焦精度是提高其空间分辨力的关键。1996 年 Kimberley F 等人在《Description and Theory of a Fiber-OpticConfocal and Super-Focal Raman Microspectrometer))中提出用光纤束代替共焦拉曼光谱显微镜的针孔的方法，实现“针孔”尺寸的非机械调节，其在扩大“针孔”时，并不降低系统的光谱分辨力;2007 年 E Kenwood Blvd 等在《Very efficient fluorescent backgroundsuppression in confocal Raman microscopy Department of Physics))中提出通过使用3-4ps的皮秒激光器结合相应的瞬时曝光技术使样品测量的荧光背景降低了约3个数量级，提高了共焦拉曼光谱显微术的分辨力；2008年N.Everall等在《The Influenceof Out-of-Focus Sample Regions on the Surface Specificity of Confocal RamanMicroscopy》中指出采用大数值孔径(NA=1.4)油浸物镜，可获得了比传统共焦拉曼光谱仪更高的轴向分辨力和信噪比，但是这种方法需要对样品进行制片，不能实现非接触和无损测量，限制了系统的应用范围；2009年M.J.Pelletier和Neil J.Everall等在((Controlof Out-of-Focus Light Intensity in Confocal Raman microscopy using opticalpreprocessing》中提出利用校正物镜或结构光瞳掩模消除了离焦位置拉曼散射的光谱强度的干扰，提高了光谱探测效率，大大降低了共焦拉曼系统离焦拉曼光谱对其有效深度分辨力的影响。上述研究，主要集中在共焦拉曼光谱显微系统涉及的光源系统、光谱探测系统、聚焦物镜系统、光谱信息处理等方面，虽然改善了光谱系统的总体性能，但在共焦拉曼光谱系统空间分辨能力的方面却没显著改善，提高拉曼光谱系统的空间分辨力仍是悬而未决的问题。在物理化学、生物医学、薄膜和药物等研究领域，分析样品的化学成分、空间分布、表面物理化学性质时常以图像的形式来获取样品更多的信息，因此需要将拉曼光谱探测由单点分析方式拓展到对一定区域范围内样品进行探测分析，即拉曼光谱成像。然而，为了获得更精确、更丰富的测量信息，拉曼光谱成像时既需较长的单点激发拉曼光谱探测时间，又需对样品进行多点拉曼光谱探测，其结果势必使拉曼光谱成像需要较长的探测时间，常达几个小时才能完成成像。但是，仪器长时间成像过程中受环境温度、振动、空气抖动等的影响较大，易使仪器系统产生漂移，从而导致样品被探测位置离焦；由于现有共焦拉曼光谱探测技术不具备实时焦点跟踪能力，因而在整个成像过程中，无法补偿样品的探测位置偏移引入的离焦误差，制约了共焦拉曼光谱成像技术空间分辨能力的提高。共焦拉曼光谱探测技术在毒品探测、宝玉石真伪鉴别、油气勘探、化学分析以及考古等研究领域对其探测聚焦光斑的尺寸要求有所差异，而现有的共焦拉曼探测技术无法精确控制聚焦光斑尺寸的大小，其结果亦限制了共焦拉曼光谱成像技术在各领域中的应用。现有共焦拉曼光谱探测仪器中，系统收集到的样品散射光束中包含的拉曼散射光极其微弱，只有系统收集到的样品散射光束中包含的瑞利光束的10_3 10_6倍，因此，在共焦拉曼光谱探测中如何利用现有光谱探测系统中遗弃的强于拉曼散射光IO3 IO6倍的瑞利光束进行辅助探测是改善共焦拉曼光谱探测技术空间分辨力的新途径。基于上述情况，本专利技术提出差动共焦探测系统利用现有共焦拉曼光谱探测系统收集到的样品散射光中遗弃的强于样品拉曼散射光IO3 IO6倍的瑞利光束进行高精度探测，使其与光谱探测系统有机融合，进行空间位置信息和光谱信息的同时探测，以期实现高空间分辨力、测量聚焦光斑尺寸可控的“图谱合一”的差动共焦图谱成像与探测，而实现高空间分辨力的光谱探测是目前光谱显微测试领域亟待解决的问题，具有极其重要的理论和学术价值。本专利技术专利的具体思路是:将激光差动共焦技术与光谱探测技术有机结合，差动共焦系统利用系统收集到的样品散射光中的瑞利光束对聚焦光斑的焦点进行实时跟踪与空间位置探测，光谱探测系统利用系统收集到的样品的散射光中的拉曼散射光进行光谱探测，然后再将差动共焦探测系统信号与拉曼光谱探测系统信号有机融合，从而实现激光差动共焦拉曼光谱系统的焦点跟踪探测和光斑尺寸可控探测，即实现拉曼光谱的高空间分辨探测。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有共焦拉曼光谱探测技术空间分辨力难以提高的不足，提出一种具有高空间分辨力的激光差动共焦图谱显微层析成像方法和装置。本专利技术的目的是通过下述技术方案实现的。本专利技术提供的激光差动共焦图谱本文档来自技高网...
【技术保护点】
激光差动共焦图谱显微成像方法，其特征在于：a)通过激发光束产生系统(1)产生激发光，经过第一分光系统(8)、物镜(10)后，聚焦在被测样品(11)上，并激发出瑞利光和载有被测样品(11)光谱特性的拉曼散射光，激发出的拉曼散射光和瑞利光被系统收集回光路中，经过物镜(10)后被第一分光系统(8)反射至二向色分光系统(13)，经二向色分光系统(13)分光后，拉曼散射光和瑞利光相互分离，瑞利光被反射进入差动共焦探测系统(14)，拉曼散射光透射进入光谱探测系统(22)，利用差动共焦曲线(43)过零点与焦点位置精确对应这一特性，通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点位置的光谱信息，实现高空间分辨的光谱探测；b)只对接收到的瑞利光信号进行差动相减处理时，系统可以进行高空间分辨的三维尺度层析成像；只对接收到的拉曼散射光的光谱信号进行处理时，系统可以进行光谱探测；同时对接收到的瑞利光和拉曼散射光的信号进行处理时，系统可以进行高空间分辨的微区图谱层析成像，即被测样品几何位置信息和光谱信息的高空间分辨的“图谱合一”；c)差动共焦曲线(43)过零点处精确对应物镜(10)的焦点O，测量过程中可以实时对被测样品(11)进行精确跟踪定焦，保证被测样品(11)在整个测量过程中始终处于焦点位置，抑制环境温度和振动等因素对光谱测量的影响，从而提高测量精度；d)差动共焦曲线(43)过零点处对应测量物镜(10)焦点O，此处聚焦光斑尺寸最小，探测的区域最小，线性区域BB“其他位置对应物镜(10)的离焦区域，在焦前或焦后BB“区域内的聚焦光斑尺寸随离焦量增大而增大，利用此特点，通过调整样品的z向离焦量，并根据实际测量精度需求来控制聚焦光斑的尺寸，实现对样品探测区域大小可控。...
【技术特征摘要】
1.光差动共焦图谱显微成像方法，其特征在于: a)通过激发光束产生系统(I)产生激发光，经过第一分光系统(8)、物镜(10)后，聚焦在被测样品(11)上，并激发出瑞利光和载有被测样品(11)光谱特性的拉曼散射光，激发出的拉曼散射光和瑞利光被系统收集回光路中，经过物镜(10)后被第一分光系统(8)反射至二向色分光系统(13),经二向色分光系统(13)分光后,拉曼散射光和瑞利光相互分离,瑞利光被反射进入差动共焦探测系统(14)，拉曼散射光透射进入光谱探测系统(22)，利用差动共焦曲线(43)过零点与焦点位置精确对应这一特性，通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点位置的光谱信息，实现高空间分辨的光谱探测； b)只对接收到的瑞利光信号进行差动相减处理时，系统可以进行高空间分辨的三维尺度层析成像；只对接收到的拉曼散射光的光谱信号进行处理时，系统可以进行光谱探测；同时对接收到的瑞利光和拉曼散射光的信号进行处理时，系统可以进行高空间分辨的微区图谱层析成像，即被测样品几何位置信息和光谱信息的高空间分辨的“图谱合一”； c)差动共焦曲线(43)过零点处精确对应物镜(10)的焦点O，测量过程中可以实时对被测样品(11)进行精确跟踪定焦，保证被测样品(11)在整个测量过程中始终处于焦点位置，抑制环境温度和振动等因素对光谱测量的影响，从而提高测量精度； d)差动共焦曲线(43)过零点处对应测量物镜(10)焦点O，此处聚焦光斑尺寸最小，探测的区域最小，线性区域BB’其他位置对应物镜(10)的离焦区域，在焦前或焦后BB’区域内的聚焦光斑尺寸随离焦量增大而增大，利用此特点，通过调整样品的z向离焦量，并根据实际测量精度需求来控制聚焦光斑的尺寸，实现对样品探测区域大小可控。2.据权利I所述的激光差动共焦图谱显微成像方法，其特征在于:激发光束是偏振光束:线偏光、圆偏光、径向偏振光；或是由光瞳滤波技术生成的结构光束，其与光瞳滤波技术联用可以压缩测量聚焦光斑尺寸，提高系统横向分辨力。3.据权利I所述的激光 差动共焦图谱显微成像方法，其特征在于:该系统还可以探测荧光、布里渊散射光、康普顿散射光等散射光谱。4.光差动共焦图谱显微成像装置，其特征在于:包括激发光束产生系统(I)、第一分光系统(8)、物镜(10)、三维扫描工作台(12)、二向色分光系统(13)、光谱探测系统(22)、差动共焦探测系统(14)及数据处理模块(34);其中，第一分光系统(8)、物镜(10)、三维扫描工作台(12)沿光路依次放置在激发光束产生系...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵维谦，崔晗，邱丽荣，王允，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：
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