本发明专利技术公开一种可快速解离型温敏性透明质酸水凝胶的制备方法，属于生物医学材料领域。以生物相容性优异和可生物降解的透明质酸为原料，以含二硫键和双端氨基的聚(N-异丙基丙烯酰胺)为交联剂，经碳二亚胺法交联反应，制得透明质酸水凝胶。该水凝胶不仅具有可从固相水凝胶解离/转变为水溶液的特性，而且其刚性可通过改变温度和交联度等灵活调控。本发明专利技术方法制备的透明质酸水凝胶具有原料易得、反应条件温和、快速解离性、温敏性、刚性可调等优点，在三维细胞培养方面，尤其是在培养结束后需要细胞-水凝胶有效分离、探讨力学信号对细胞生长行为影响规律方面，具有潜在用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医用材料领域，具体涉及一种适用于细胞三维培养的可快速解离型温敏性透明质酸水凝胶的制备方法。
技术介绍
越来越多的研究表明，目前基于培养板二维单层培养的细胞，其生长行为、蛋白表达和细胞功能等方面并不能客观反映体内细胞的真实情况。学者们认为，这是由于二维培养环境与体内细胞所处的三维微环境不同造成的，前者忽略了细胞-细胞间、细胞-基质间相互作用对细胞生长的影响。因此，近些年三维细胞培养技术受到广泛重视，并得到快速发展。与二维培养的细胞相比，三维培养的细胞在细胞表型、生长行为、能量代谢等方面更具生理学意义。三维培养技术不仅极大地推动了组织工程技术的快速发展，而且在细胞/分子生物学、肿瘤发生发展模型、药物筛选、临床药效评价与预测等方面发挥着越来越大的作用。基于仿生角度考虑，通过包埋方式实现三维细胞培养所采用的材料多是基质胶，如Matrigel等，但其存在批次差异性大、成分复杂且不确定、加工性能和强度差、致病风险等问题，且主要限于体外研究。为此，人们开始寻找基质胶的替代品，主要为各种生物高分子材料，如透明质酸、藻酸盐、壳聚糖和合成聚酯等。在许多情况下，需要在三维细胞培养结束时将细胞与基质材料分离，以便深入研究三维基质结构和理化特性以及药物干预对细胞生长行为、基因和蛋白表达的情况。这对细胞基质提出了更高的要求，现有基质材料虽然具有良好的生物相容性和生物可降解性，但降解速度普遍较慢，且力学性能可调性不够理想，难以满足这一实际应用 需求。透明质酸是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺为重复单元的线性高分子，是构成人体细胞外基质、关节滑液等结缔组织的主要成分，具有维持细胞外空间结构、调节渗透压、润滑、促进细胞修复等生理功能。透明质酸良好的生物相容性、亲水性、保湿性和生物可降解性等性质，使其在食品和化妆品等领域得到广泛应用。最近，以透明质酸为主要原料制备的水凝胶，在生物医药
受到重视，尤其在细胞三维培养、肿瘤模型、药物缓释、组织工程等方面应用潜力很大。然而，透明质酸存在力学性能差、化学稳定性较差、易被体内透明质酸酶快速降解等问题，限制了其在生物医药
中的应用。为此，已开发出针对透明质酸的多种改性技术，如酯化、氨基化、巯基化、共混复合、接枝、交联等，以提高其力学性能，改善理化性质。如接枝聚(N-异丙基丙烯酰胺)的透明质酸在体温下可形成水凝胶，具有一定的机械强度[HP Tan, et al.Thermosensitive injectable hyaluronicacid hydrogel foradipose tissue engineering.Biomaterials, 2009, 30:6844-6853],但这种强度源于聚(N-异丙基丙烯酰胺)的温敏性，致使水凝胶均匀性、稳定性和持久性不理想。而采用传统化学交联方法制备的透明质酸水凝胶稳定性好[J Yeom, etal.Effectof cross-linking reagents for hyaluronic acid hydrogel dermal fillerson tissueaugmentation and regeneration.Bioconjugate Chem.2010，21:240-247],其力学性能可通过控制交联度等参数在较宽范围内调节，其虽然可以逐渐降解，但无法满足细胞三维培养结束时所需的细胞-基质快速分离需求。因此，开发具有环境敏感性和快速解离性质的透明质酸水凝胶，用于细胞三维培养体系的建立就显得尤其重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种兼具快速解离性质和可调力学行为的可快速解离型温敏性透明质酸水凝胶的制备方法。将该水凝胶用作细胞三维培养基质，可实现细胞三维培养结束后细胞与基质快速分离的要求，并可用于研究环境力学信号对细胞行为与功能的影响规律。为达到上述目的，本专利技术以生物相容性优异和生物可降解的透明质酸为原料，以具有温敏性的窄分子量分布的含二硫键和双端氨基的聚(N-异丙基丙烯酰胺)为大分子交联剂，经室温碳二亚胺法交联反应，制得可快速解离型温敏性透明质酸水凝胶。本专利技术采用的技术方案如下:1首先，将透明质酸溶于高纯水中，配制成质量浓度为1°/Γ4%的透明质酸溶液；2)其次，在该溶液中加入透明质酸质量10°/Γ60%的分子量0.5万飞万的含有二硫键和双端氨基的窄分子量分布的聚(N-异丙基丙烯酰胺)的温敏性大分子交联剂搅拌溶解后，用盐酸或NaOH溶液调节pH值为4 6.5 ；3) 最后，在溶液中加入摩尔比为1:1.1的1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或EDC与1-羟基苯并三唑(HOBT)的混合物，其中EDC与交联剂的摩尔比为5:广15:1，搅拌均匀后将溶液加入模具中，经真空脱气泡后避光室温反应24小时 48小时后脱模、透析，得到可快速解离型温敏性透明质酸水凝胶。所述的透明质酸分子量为2万 60万。所述的含有二硫键和双端氨基的窄分子量分布的聚(N-异丙基丙烯酰胺)的温敏性大分子交联剂由如下步骤合成:I)以S，S’ - 二(α，α ’ -甲基-α 〃_乙酸)三硫代碳酸酯为链转移剂，以N-异丙基丙烯酰胺为单体，加入链转移剂质量十分之一的引发剂偶氮二异丁氰或4，4’ -偶氮双(氰基戊酸)，在无水无氧有机溶剂中、60°C 70°C下采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合反应24小时 48小时，反应体系经沉淀剂沉淀，得到双端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)，其中链转移剂与单体摩尔比为1:45 1:500 ；2)将步骤I)得到的双端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)溶于含过量氨解剂的无水二氧六环中，回流反应48小时 72小时，经沉淀剂沉淀、40°C真空干燥后，得到分子量为0.5万飞万的含二硫键的双端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)；3)将步骤2)得到的含二硫键的双端羧基聚(N-异丙基丙烯酰胺)和含二硫键的二元胺按1:15 1:30的摩尔比溶于高纯水中，用盐酸调节pH值为5，再加入羧基摩尔数1.5^3倍的EDC，室温反应24小时 48小时，反应体系经对水透析2天、冷冻干燥后得到白色粉末，即含二硫键和双端氨基的聚(N-异丙基丙烯酰胺)。所述的无水无氧有机溶剂为1，4- 二氧六环或四氢呋喃。所述的沉淀剂为乙醚、甲醇、正己烷、乙醚-正己烷或甲醇-正己烷。所述的氨解剂为正己胺、环己胺或正丁胺。所述的含有二硫键的二元胺为胱胺、胱氨酸二甲酯或二硫代二丙酰肼。本专利技术制备的可快速解离型温敏性透明质酸水凝胶中含有二硫键可被其特异性还原剂还原如半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽、2-巯基乙胺、二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦等，表现为透明质酸水凝胶的快速解离，从凝胶状态转变为溶液。当温度在室温(25° C)和体温(37° C)之间变化时，水凝胶具有可逆的溶液-凝胶转变特性。与现有透明质酸水凝胶及制备技术相比，本专利技术的优点在于:I)该透明质酸水凝胶兼具聚(N-异丙基丙烯酰胺)的温敏性和基于二硫键的快速解离性质。 2)在二硫键特异性还原剂作用下，可使该水凝胶快速解离，实现凝胶状向溶液的转变。该性质可实现细胞三维培养结束后，细胞与载体材料的有效分离。3)可实现透明质酸水凝胶力学性质如强度、模量等的灵活调控本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可快速解离型温敏性透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1）首先，将透明质酸溶于高纯水中，配制成质量浓度为1%~4%的透明质酸溶液；2）其次，在该溶液中加入透明质酸质量10%~60%的分子量0.5万~5万的含有二硫键和双端氨基的窄分子量分布的聚(N?异丙基丙烯酰胺)的温敏性大分子交联剂搅拌溶解后，用盐酸或NaOH溶液调节pH值为4~6.5；3）最后，在溶液中加入摩尔比为1：1.1的1?(3?二甲氨基丙基)?3?乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与N?羟基琥珀酰亚胺（NHS）或EDC与1?羟基苯并三唑（HOBT）的混合物，其中EDC与交联剂的摩尔比为5:1~15:1，搅拌均匀后将溶液加入模具中，经真空脱气泡后避光室温反应24小时~48小时后脱模、透析，得到可快速解离型温敏性透明质酸水凝胶。
【技术特征摘要】
1.一种可快速解离型温敏性透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤: O首先，将透明质酸溶于高纯水中，配制成质量浓度为1°/Γ4%的透明质酸溶液； 2)其次，在该溶液中加入透明质酸质量10°/Γ60%的分子量0.5万飞万的含有二硫键和双端氨基的窄分子量分布的聚(N-异丙基丙烯酰胺)的温敏性大分子交联剂搅拌溶解后，用盐酸或NaOH溶液调节pH值为4 6.5 ； 3)最后，在溶液中加入摩尔比为1:1.1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或EDC与1-羟基苯并三唑(HOBT)的混合物，其中EDC与交联剂的摩尔比为5: f 15:1，搅拌均匀后将溶液加入模具中，经真空脱气泡后避光室温反应24小时 48小时后脱模、透析，得到可快速解离型温敏性透明质酸水凝胶。2.根据权利要求1所 述的可快速解离型温敏性透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于:所述的透明质酸分子量为2万飞O万。3.根据权利要求1所述的可快速解离型温敏性透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于:所述的含有二硫键和双端氨基的窄分子量分布的聚(N-异丙基丙烯酰胺)的温敏性大分子交联剂由如下步骤合成: 1)以S，S’_二(α，α’ -甲基-α〃_乙酸)三硫代碳酸酯为链转移剂，以N-异丙基丙烯酰胺为单体，加入链转移剂质量十分之一的引发剂偶氮二异丁氰或4，4’ -偶氮双(氰基戊酸)，在无水无氧有机溶剂中、60°C 70...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱军民，崔宁，王小娜，冯家浩，叶帆，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：
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