本发明专利技术公开了一种利用粉红粘帚霉－转基因植物体系修复重金属、有机物污染土壤，特别是修复重金属-有机物复合污染土壤的方法。其特征在于：将可增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因引入植物，构建一种对重金属污染、有机物污染，特别是对重金属－有机物复合污染都有较好修复作用的转基因植物；在种植转基因植物同时，施用粉红粘帚霉，形成粉红粘帚霉－转基因植物体系，从而高效修复被污染土壤。本发明专利技术对于以下三种类型的污染土壤都有较好的修复作用:(1)有机污染物如多环芳烃，三氯乙烯、二溴乙烷等卤代烃化合物污染土壤；(2)多种重金属如Cd、Cr、Cu、Mn、Zn及Pb等污染的土壤；（3）重金属-有机物复合污染土壤。其过程包括：转基因植物的构建，阳性植株的筛选及培养，建立粉红粘帚霉－转基因植物体系，进行污染土壤的修复。本发明专利技术在重金属污染、有机物污染、重金属-有机物复合污染的土壤修复中具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术及环境保护领域，特别是涉及一种用转基因植物一粉红粘帚 霉体系修复重金属、有机物污染土壤，特别是重金属-有机物复合污染土壤的方法。
技术介绍
随着城镇化、工业化、汽车尾气排放以及农业的集约化发展，环境问题越来越受 到人们关注，重金属、有机物引起的土壤污染也日益成为环境、土壤科学家们研究的热点 问题。土壤被重金属及有机物污染后，不仅直接影响作物产量和品质，还会通过食物链影 响人体健康和安全。利用绿色植物清除污染物的策略，即植物修复技术具有成本低，环 境友好和可再利用等特点，是一种非常有前途的环境污染原位治理途径。转基因植物由于 具有更好的耐受力和积累量，可以得到更好的土壤修复效果。用转基因植物修复污染土壤， 已经成为各国科学家研究的重点之一。
技术实现思路
转基因植物一粉红粘帚霉体系粉红粘帚霉(C7rosea)是一种广泛存在于土壤中的植物病原真菌的重寄 生菌，可以促进植物生长发育，提高植物耐旱耐涝、耐高、低温能力，对贫瘠土地的植物生长 有较好促进作用，且具有较好的生物防治能力，为非致病菌。粉红粘帚霉对人、畜无毒无害， 可防治多种蔬菜病害，是一种很有价值的绿色生物农药。本专利技术主要应用了粉红粘帚霉的 促生作用。复合污染对植物造成严重的损害和生长抑制，所以，本团队提出，在种植转基因植 物的同时施用粉红粘帚霉，以形成转基因植物一粉红粘帚霉体系，可望大幅度增强转基因 植物对复合污染的耐受性和累积能力，从而大幅度提高转基因植物对复合污染土壤的修复 能力。本团队的实验已经证实，用转基因植物一粉红粘帚霉体系可以显著增加转基因植物 的修复能力。尽管目前还未见粉红粘帚霉用于污染土壤修复的报道。本团队自己生产了粉红粘帚霉孢子制剂，可以用于污染土壤的修复。同时，也可从 市场上购买粉红粘帚霉孢子制剂，用于修复污染土壤。2. 2转基因植物修复重金属污染在转基因植物修复中，植物鳌合肽技术得到较多应用。美国的Bennett等分别比较了 表达Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(ECS)或谷胱苷肽合成酶(GS)或ATP硫酸化酶(APS)基 因的印度芥菜对土壤的修复效果，结果表明，表达Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(ECS)或谷胱 苷肽合成酶(GS)的植株，植物鳌合肽和谷胱苷肽的水平增加，对镉的耐受力和积累量也提 高。表达ATP硫酸化酶的植株，其谷胱苷肽和硫醇的含量均有所提高。ECS和GS植株茎叶 的重金属累积量显著高于野生株，其中镉为1. 5倍，锌为1. 5 — 2倍，对于铬、铜、铅，ECS植 株的累积量为野生株的2. 4 — 3倍。所有的转基因植株从土壤中清除的重金属量均显著高 于野生株，土壤中镉、锌的减少量分别为25%和6%。上述几种转基因植株中，ECS植株的表现最佳。Li等将Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶(ECS)基因在拟南芥中表达，使谷胱甘肽在茎 叶和根中的含量较野生株增加了 2 — 5倍，有效提高了植物对砷、汞的耐受力。Pomponi教授 等将拟南芥的植物鳌合肽基因在烟草中表达，提高了植株对Cd的耐受性和积累量。2007 年，美国的Banuelos等将半胱氨酸裂合酶(cpSL)和半胱氨酸转甲基酶(SMT)基因分别转 入印度芥菜中表达，用转基因植株修复硒污染的土壤。结果，春季种植的转cpSL基因的植 株对硒的累积量增加到原来的2倍，与野生型植株相比，叶子中硒浓度提高了1. 8倍。转 SMT基因的植株叶子中硒浓度比野生型植株提高了1. 7倍。秋季种植的转SMT基因的植 株对硒的累积量是野生植株的1. 6倍，且茎、叶中硒的浓度都较高。这些结果表明，cpSL、 SMT的转基因印度芥菜对硒的累积能力显著提高。LeDuc等研究者分别在拟南芥和印度芥 末中同时表达ATP硫酸化酶和半胱氨酸甲基转移酶，使植株对硒的积累量提高了 4 一 9倍。 Banuelos等研究者进行了转基因印度芥菜的大田试验，在转基因植株中表达了半胱氨酸裂 合酶或半胱氨酸甲基转移酶，结果表明，硒的积累量提高了 1.6 — 2倍。Gasic等将拟南 芥的植物鳌合肽基因在印度芥菜中表达，提高了植株对镉的耐受性。除了鳌合肽技术外，其它的转基因植物也用于重金属污染修复。日本的Yazaki K等异源表达哺乳动物的ABC转运器基因于烟草中，可以同时提高 对有机和无机污染物的耐受性，因而，可望用于复合污染的植物修复。但是，ABC表达的不够 稳定。Sasaki等在拟南芥中表达细菌萊转运蛋白基因,构建了超级萊积累植株。Kim等在 拟南芥中表达ABC转运器AtH)R8，提高了对镉的耐受力。2006年，美国的Lindblom等将高 亲和的硫酸盐传输子基因在印度芥末中表达，明显提高了植株对Cr，Cd, V和W的耐受力。 日本科学家Sasaki等将硫杆菌的汞膜转运蛋白在拟南芥中表达，构建了超级耐汞植物，其 汞积累量为野生植物的2倍。Nagata等将细菌磷酸激酶基因在烟草中表达，提高了植株的 汞耐受性和积累量。转基因植物修复有机物污染三氯乙烯(TCE)等是污染量较大的有机污染物，特别是对地下水的污染较多。细胞色素 P450 2E1酶可以氧化多种污染物，包括三氯乙烯、溴乙烯、氯仿、四氯化碳及氯乙烯等，对多 种主要的土壤污染物有效，因此P450 2E1 (CYP 2E1)被认为是增强植物有机污染修复效 率的候选基因。 美国科学家Doty等将人类细胞色素基因P450 2E1转入烟草，用其修复污染土壤。 P450 2E1转基因烟草对TCE的代谢能力较空白对照株提高达640倍。转基因植株明显增加 了对溴乙烯的摄取和脱溴作用。所以，P450 2E1植株可用于卤化物污染的植物修复，有效 修复卤化物污染。2006年，Rylott等在拟南芥中表达降解环三甲撑三硝胺(RDX)的细胞 色素P450，提高了其对RDX的耐受力，在含RDX环境中，茎叶及根的生长均优于野生植株。 希腊学者Karavangeli等构建转基因烟草，表达玉米的谷胱苷肽转移酶基因，提高了对对 氯乙酰苯胺除草剂的降解能力。将细菌氯儿茶酚双加氧酶基因在拟南芥中表达，转基因拟 南芥表现出明显高的清除儿茶酚的能力，可以用作芳香污染物的植物修复。同时表达多个基因可产生协同作用。Inui H等在马铃薯中表达人类P450基 因CYP1A1, CYP2B6, CYP2C9 和 CYP2C19。结果表明，同时转入 CYP1A1, CYP2B6,及 CYP2C19基因的植株T1977，表现出对多种除草剂的交叉抵抗力；表达CYP2C19基因的植株2C9-57R2,对磺脲类药物有较强耐受力；表达CYP2C9基因的植株2C19-12R1，对多种除 草剂有较强的交叉耐受力。上述结果表明多基因协同作用，提高了转基因马铃薯的修复能 力。Kawahigashi等采用质粒pIKBACH，将人类细胞色素P450的基因CYP1A1，CYP2B6,和 CYP2C19同时在水稻中表达，大幅度提高了水稻对除草剂莠去津和异丙甲草胺的耐受力，可 以对有机污染的土壤进行植物修复。Wawrzynski等将丝氨酸乙酰转移酶基因、Y -谷氨酰 半胱氨酸酶基因和植物鳌合肽合成酶基因同时在植物中表达，使镉的积累量提高8倍，而 表达单一基因的植株，镉的累积量提高较少。这表明，同时表达多个基因，具有协同作用。美本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用粉红粘帚霉－转基因植物体系修复重金属、有机物污染土壤，特别是修复重金属?有机物复合污染土壤的方法，其特征在于在污染土壤中种植转基因植物并施用粉红粘帚霉，建立粉红粘帚霉－转基因植物体系用以修复被污染土壤；所述的粉红粘帚霉（Clonostachys?rosea）是一种广泛存在于土壤中的植物病原真菌的重寄生菌，具有植物促生作用，可以促进植物生长发育，提高植物耐旱耐涝、耐高、低温能力，还有较好的生物防治能力，为非致病菌；施用粉红粘帚霉的方式是施用粉红粘帚霉孢子制剂，特别是施用粉红粘帚霉孢子粉剂；粉红粘帚霉分生孢子和厚垣孢子均可施用；施用粉红粘帚霉孢子粉剂的方法有两种：（1）、在转基因植物苗根部区域施用粉红粘帚霉孢子粉剂，使根部区域的孢子浓度为103?5孢子/克土壤；（2）、用粉红粘帚霉孢子粉剂拌转基因植物种子，拌种用孢子粉剂的孢子浓度为103?5孢子/克；所述转基因植物是将可增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因引入植物，从而获得可修复重金属和有机物复合污染土壤的转基因植物；所述可增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因如下：来源于哺乳动物的金属硫蛋白（MT）基因、来源于高等植物的类MT基因或者来源于哺乳动物的细胞色素P450 2E1基因、1?氨基环丙烷?1?羧酸（ACC）脱氨基酶基因、γ?谷氨酰半胱氨酸合成酶基因（γ?ECS）；所述的有机物为多环芳烃（PAHs），三氯乙烯、二溴乙烷等卤代烃化合物；所述的重金属为Cd、Cr、Cu、Mn、Zn和Pb；所述的污染土壤为重金属污染的土壤，有机物污染的土壤，重金属?有机物复合污染的土壤；所述的植物为烟草、花椰菜、紫花苜蓿、印度芥菜。...
【技术特征摘要】
1.一种利用粉红粘帚霉一转基因植物体系修复重金属、有机物污染土壤，特别是修复重金属-有机物复合污染土壤的方法，其特征在于在污染土壤中种植转基因植物并施用粉红粘帚霉，建立粉红粘帚霉一转基因植物体系用以修复被污染土壤； 所述的粉红粘帚霉{Clonostachys rosea )是一种广泛存在于土壤中的植物病原真菌的重寄生菌，具有植物促生作用，可以促进植物生长发育，提高植物耐旱耐涝、耐高、低温能力，还有较好的生物防治能力，为非致病菌；施用粉红粘帚霉的方式是施用粉红粘帚霉孢子制剂，特别是施用粉红粘帚霉孢子粉剂；粉红粘帚霉分生孢子和厚垣孢子均可施用；施用粉红粘帚霉孢子粉剂的方法有两种(I)、在转基因植物苗根部区域施用粉红粘帚霉孢子粉剂，使根部区域的孢子浓度为103_5孢子/克土壤；(2)、用粉红粘帚霉孢子粉剂拌转基因植物种子，拌种用孢子粉剂的孢子浓度为1...
【专利技术属性】
技术研发人员：张媛媛，刘均洪，张玉艳，巩婷云，王静，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：
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