一种麻痹性贝毒与载体蛋白的连接方法技术

本发明专利技术涉及一种麻痹性贝毒与载体蛋白的连接方法。应用本发明专利技术的方法，可获得稳定偶联的麻痹性贝毒C1&C2与载体蛋白偶联产物，从而为麻痹性贝毒抗体的制备、麻痹性贝毒C1&C2的免疫学检测分析提供有效途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及。
技术介绍
20世纪50年代以后，海洋赤潮发生频繁，赤潮毒素对人类造成的危害事件也日益增多。目前赤潮中将近有20种腰鞭毛虫和少数的硅藻可以产生藻黄素。贝类通过滤食有毒微藻(主要是藻黄素)，经过生物累积和放大转化为有机毒素，即贝毒。贝毒危害具有突发性和广泛性，由于其毒性大、反应快、无适宜解毒剂给防治带来了许多困难。因此，开展贝毒研究对确保水产品及人类生命财产安全具有重要意义。麻痹性贝毒是一种低分子量、高毒性的贝类毒素，主要由甲藻Alexandrium tamarense，A. catenella，A. acatenella，A. cohorticula，A. fundyense，A. fraterculus，A. nimutum,A. Gonyaulaxtamarensis,Gymnodinium catenatum，Pyrodinium babamense varcompressum等以及一种淡水蓝绿藻Aphanizomenon flos-aquae产生，通过对钠离子通道的影响而抑制神经的传导，为神经毒素的一种。麻痹性贝毒是一类小分子的烷基氢化嘌呤化合物，这是一类非洁净、高极性、不挥发的化学物质，通常呈碱性，水溶性高，可溶于甲醇、乙醇，不溶于大部分非极性溶剂。麻痹性贝毒是一类四氢嘌呤的三环化合物，已发现的毒素根据基团的相似性，可分为四类氨基甲酸酯类毒素(Carbamate toxins),包括石房蛤毒素(Saxitoxin, STX),新石房蛤毒素(Neosaxitoxin, ΝΕΟ),膝沟藻毒素(Gonyautoxin),包括膝沟藻毒素GTX1,GTX2，GTX3 和 GTX4 ;N_ 磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)，包括 Cl、C2、C3、C4> GTX5 (BI)和 GTX6 (B2);脱氛甲酸基类毒素(Decarbamoyltoxins),包括 Decarbamoylsaxitoxin(dcSTX), Decarbamoyl neosaxitoxin(dcneoSTX), Decarbamoylgonyautoxinsl-4(dcGTXl-4);脱氧脱氨甲酰基类毒素(Deoxydecarbamoyl toxins)。现有技术中，贝毒的检测主要有小白鼠生物试验法、化学仪器分析技术和免疫学方法三种，其中免疫学检测方法具有时间短，操作简便，特异性好等优点。但是需要得到针对贝毒的特异性抗体，而贝毒为小分子化合物，免疫原性不够，不能直接刺激机体产生特异性抗体，需要与载体蛋白连接后免疫动物，目前并没有贝毒C1&C2与载体蛋白连接成功的案例。因此，本领域亟需研究贝毒C1&C2与载体蛋白成功连接的问题，从而为麻痹性贝毒C1&C2抗体的制备、水产品中麻痹性贝毒C1&C2残留的免疫学方法检测分析提供有效途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。在本专利技术的第一方面，提供，所述方法包括(I)将麻痹性贝毒C1&C2溶于pH值5. 0-6. O偶联缓冲液中，使麻痹性贝毒C1&C2浓度在l_4mg/ml ;之后加入载体蛋白，使之终浓度l_40mg/ml ;混匀再加入甲醛，混合反应60-90小时；(2)将(I)的反应产物进行透析，获得麻痹性贝毒C1&C2与载体蛋白的偶联产物。在本专利技术的一个优选方式中，所述的载体蛋白选自(但不限于)匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白或卵清蛋白。在本专利技术的另一优选方式中，所述的载体蛋白是血清白蛋白较佳地，所述的载体蛋白是牛血清白蛋白或人血清白蛋白。在本专利技术的另一优选方式中，所述的偶联缓冲液是pH5的醋酸钠缓冲液；较佳地， 醋酸钠含量16. 4g/L。在本专利技术的另一优选方式中，所述的麻痹性贝毒C1&C2在偶联缓冲液中的浓度为2_3mg/ml ;或加入的载体蛋白的终浓度2_30mg/ml。在本专利技术的另一优选方式中，所述的甲醛是37%甲醛溶液，加入量为偶联缓冲液体积的1-10% ;较佳地，所述的甲醛溶液加入量为偶联缓冲液体积的2-6%。在本专利技术的另一优选方式中，步骤(I)包括将Img麻痹性贝毒C1&C2溶解于500ul pH值5. 0-6. O的偶联缓冲液中，加入1-1Omg载体蛋白，混匀，再加入37%甲醛溶液20ul，混合反应72小时；和步骤(2)包括将麻痹性贝毒C1&C2与载体蛋白偶联产物放入透析袋中，用pH7. 2的PBS溶液在4°C透析72小时，期间换透析液3次。在本专利技术的另一优选方式中，步骤(2)之后，还包括步骤将透析产物电泳鉴定。在本专利技术的另一方面，提供一种麻痹性贝毒与载体蛋白的偶联产物，其由所述的方法制备获得。在本专利技术的另一方面，提供所述的麻痹性贝毒与载体蛋白的偶联产物的用途，用于麻痹性贝毒C1&C2的抗体的制备；或用于水产品中麻痹性贝毒C1&C2残留的免疫学方法检测分析。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、麻痹性贝毒C1&C2-载体蛋白偶联产物的电泳图。Lanel/2/3 :牛血清白蛋白；Lane4/5/6 :透析后的麻痹性贝毒C1&C2-牛血清白蛋白偶联广物。图2、实施例2偶联方法的产物的电泳图。Lanel :牛血清白蛋白；Lane2/3 :偶联产物。具体实施例方式本专利技术人针对现有技术中难以获得麻痹性贝毒C1&C2的抗体的缺陷，经过深入的研究，首次揭示一种麻痹性贝毒C1&C2与载体蛋白的偶联方法。应用本专利技术的方法，可获得稳定偶联的麻痹性贝毒C1&C2与载体蛋白偶联产物。如本文所用，“免疫活性”或“免疫原性”指诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。如本文所用，“麻痹性贝毒C1&C2”是指麻痹性贝毒Cl和C2混合物，Cl和C2结构及其类似，常以混合物形式存在。本专利技术中，所述的载体蛋白可以选自匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白或卵清蛋白。这些载体蛋白均是本领域技术人员易于获得的，例如牛血清白蛋白可以购自美国sigma公司。上述载体蛋白的突变体、类似物或衍生物也可被应用于本专利技术，只要它们仍然保持了所述载体蛋白的功能，可与麻痹性贝毒C1&C2实现偶联并使之具有免疫原性。针对麻痹性贝毒C1&C2难以与载体蛋白偶联的问题，本专利技术人进行了反复而深入的研究，优化了各项实验条件。作为本专利技术的优选实施方式，所述方法包括将Img麻痹性贝毒C1&C2溶解于500ul pH值5. 0-6. O的偶联缓冲液中，加入1-1Omg载体蛋白，混匀，再加入37%甲醛溶液20ul，混合反应72小时；和将麻痹性贝毒C1&C2与载体蛋白偶联产物放入透析袋中，用PH7. 2的PBS溶液在4°C透析72小时，期间换透析液3次。最后，还可包括将透析产物电泳鉴定的步骤。本专利技术人在实验中发现，适当的pH值对于麻痹性贝毒C1&C2与载体蛋白的成功偶联是较为关键的。当PH低于5的条件下，偶联的效率非常低，难以获得稳定的偶联产物。本专利技术中，还提供了采用本专利技术的方法制备获得的C1&C2-载体蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种麻痹性贝毒与载体蛋白的连接方法，其特征在于，所述方法包括：(1)将麻痹性贝毒C1&C2溶于pH值5.0?6.0偶联缓冲液中，使麻痹性贝毒C1&C2浓度在1?4mg/ml；之后加入载体蛋白，使之终浓度1?40mg/ml；混匀再加入甲醛，混合反应60?90小时；(2)将(1)的反应产物进行透析，获得麻痹性贝毒C1&C2与载体蛋白的偶联产物。

【技术特征摘要】
1.一种麻痹性贝毒与载体蛋白的连接方法，其特征在于，所述方法包括 (1)将麻痹性贝毒C1&C2溶于pH值5.0-6. O偶联缓冲液中，使麻痹性贝毒C1&C2浓度在l-4mg/ml ;之后加入载体蛋白，使之终浓度l_40mg/ml ;混勻再加入甲醒,混合反应60-90小时； (2)将(I)的反应产物进行透析，获得麻痹性贝毒C1&C2与载体蛋白的偶联产物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的载体蛋白选自匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白或卵清蛋白。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的载体蛋白是血清白蛋白较佳地，所述的载体蛋白是牛血清白蛋白或人血清白蛋白。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的偶联缓冲液是PH5的醋酸钠缓冲液；较佳地，醋酸钠含量16. 4g/L。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的麻痹性贝毒C1&C2在偶联缓冲液中的浓度为2-3mg/ml ;或 加入的载体蛋白的终浓度2-30mg/ml。6.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵钧，吴杨，蔡兴锋，
申请(专利权)人：上海生物芯片有限公司，上海友科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：