本发明专利技术公开了一种基于量子点对细胞中重金属离子原位实时检测的方法，其步骤：A、配制一定浓度羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液；B、将T25细胞培养瓶中已长满的狗肾细胞消化为单细胞悬浮液，接种到细胞培养皿中，培养；C、向培养皿中加入羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液，孵育一段时间后得到标记上荧光的狗肾细胞。D、向培养皿中洗涤后的细胞中分别加入含有梯度浓度和未知浓度重金属离子的DMEM营养液，与细胞共同孵育后，用流式细胞仪分别检测细胞的平均荧光强度，通过细胞荧光强度的变化绘制标准曲线即可计算出细胞中重金属离子的浓度。方法操作简便，标记后细胞的荧光会随重金属离子的增加发生有规律的猝灭，实现了对细胞中的外源重金属离子的实时原位检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米材料用于标记生物体系的分析检测
，更具体涉及一种量子点将细胞标记上荧光后利用细胞的荧光强度变化检测汞、铜等重金属离子与细胞相互作用效应的方法，可以用于原位实时检测细胞中的汞、铜等重金属离子含量，也可用于汞、铜等重金属离子对细胞生理活动影响的研究及细胞对汞、铜等重金属离子运输途径的研究。
技术介绍
细胞是生物体的基本结构单位，生物的各项生理功能和反应，都是以细胞和其产物为物质基础进行的。大多数重金属离子以微量或痕量的水平存在于机体内，在各组织和循环系统中以流动态分布。重金属离子在转运蛋白的作用下，广泛地分布于各细胞组织中。金属离子及其化合物从胞外进攻细胞时，不但可以进入细胞，并且会与细胞发生多种相互作用。研究细胞中重金属离子的浓度水平及重金属离子与细胞的相互作用效应，在化学、生物学、环境科学、医药科学及生命科学等众多领域均具有重要意义。量子点(Quantum dots, QDs)又称半导体纳米微晶体(Semiconductornanocrystals),是半径小于或接近于激子玻尔半径的一类半导体纳米粒子。量子点具有一般纳米微粒的基本性质如表面效应、体积效应和量子尺寸效应，具有宽的激发光谱、窄的发射光谱、可精确调谐的发射波长、可忽略的光漂白等优越的荧光特性。由于量子点粒径很小而比表面积很大，其光学性质受表面结构影响非常明显。小分子或离子等物质结合到量子点表面时，就会改变量子点表面组分以及电荷，甚至还会引起核心电子空穴的重组，导致荧光强度的增强或荧光猝灭。因此可以通过量子点荧光强度的变化，应用荧光猝灭方程或荧光加强效应方程来进行相应的分析。目前，用于检测细胞内汞、铜等重金属离子的方法有多种，如原子吸收/发射光谱法，高效液相色谱法，电感耦合等离子体质谱法，电化学法，化学发光法等，这些方法具有较高的灵敏度和选择性并常用于定量分析，然而它们不适用于在生物体内原位实时检测汞、铜离子，不能描述汞、铜离子在细胞内的分布和动态变化。与上述方法相比，荧光检测法由于具有较好的选择性、高灵敏度、不影响细胞正常的生理功能和易于实现在线检测等优点而具有广泛的应用前景。寻找新的生物相容性好的金属离子生物荧光探针并将其运用到细胞中重金属离子的原位检测已成为现代生物分析中的一大前沿课题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有检测技术中对细胞中重金属离子原位实时检测存在的困难，提供一种，方法操作简便，标记后细胞的荧光稳定时间长，荧光探针未显示细胞毒性，不影响细胞的正常生长。实现了对细胞中的外源重金属离子实时原位检测。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施本专利技术的基本构思是部分金属离子与量子点结合后，可以改变量子点表面组分以及电荷，甚至还会引起核心电子空穴的重组，导致量子点的自身的荧光产生明显的猝灭效应，且荧光猝灭作用符合Stern-Volmer方程。而量子点对细胞的荧光标记，其实质是量子点通过内吞作用或细胞膜的孔隙进入细胞内或线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体和细胞核等细胞器内，与细胞中的蛋白质和酶发生了相互作用。因此当汞、铜等重金属离子进入细胞后，可以对细胞中的量子点荧光产生猝灭效应，从而在宏观上体现出细胞的平均荧光强度遭到了猝灭。通过对细胞平均荧光强度的检测并利用动态猝灭方程即可以获得进入细胞中汞、铜等重金属离子浓度的信息，达到对细胞内汞、铜离子原位实时检测的目的。一种，包括如下步骤1、配制O. 0000025-0. 001mol/L的羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液{羧甲基壳聚糖-CdTe量子点自制，制备的简要过程如下=CdCl2溶液和巯基乙酸溶液混合均匀后用NaOH 溶液调整其PH值为碱性，再向该溶液中加入新制备的KTeH4溶液。将此混合液转入聚四氟乙烯微波消解罐，放入可控温的微波加热系统进行加热，反应完成后待溶液冷却至室温 20-250C，即可得到CdTe量子点溶液。为去除CdTe量子点溶液中较大粒径的CdTe量子点及反应过程中多余的Cd2+和TGA等小分子物质，将该溶液通过高速离心(20000r/mirT25000r/ min)和透析(PBS缓冲溶液透析24 48小时)处理，即可得到荧光强度高，杂质含量低的CdTe 量子点溶液。本领域的普通技术人员不付出任何创造性劳动均能制备}:根据羧甲基壳聚糖-CdTe量子点的浓度，用移液管移取O. r5mL的羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液于灭菌的IOml容量瓶中，加入高纯水(电阻率大于18ΜΩ ^m)定容，备用；所选用的壳聚糖-量子点荧光探针是由羧甲基壳聚糖和纯化后的CdTe量子点在水相反应形成，具有良好的水溶性和生物相容性。 2、将T25细胞培养瓶中已长满且生长状态良好的狗肾细胞(MDCK)用O. 05%体积比的EDTA-胰蛋白酶消化为单细胞悬浮液，细胞计数后取I X IO4^l X IO7的狗肾细胞接种到多个细胞培养皿中，加入含10%体积比的胎牛血清的DMEM营养液。在37°C、5%体积比的CO2 细胞培养箱中培养，使细胞正常贴壁生长繁育，得到用于实施标记的狗肾细胞。3、待步骤2狗肾细胞贴壁生长12^36小时后，向培养皿中加入羧甲基壳聚糖-CdTe 量子点荧光探针，于37°C、5%体积比的CO2细胞培养箱中与细胞共同孵育6 48小时，即可得到带有荧光的狗肾细胞。弃去DMEM营养液，用磷酸盐缓冲溶液(pH=7. 4)洗涤2次，以除去未进入细胞的CMC-CdTe量子点。4、向步骤3得到的多个培养皿中洗涤后的狗肾细胞中加入含有梯度浓度重金属离子的DMEM营养液(购于美国CIBCO公司)，与细胞共同孵育12 72小时，弃去营养液，用 EDTA-胰蛋白酶(购于美国CIBCO公司)对培养皿底部的细胞进行消化，消化完全后加入ImL 生理盐水轻轻吹打使细胞脱离培养皿，将该细胞悬浮液分别转入5mL试管。将试管置于离心机中，2000转/min离心5min，弃去上清液，加入生理盐水后用漩涡振荡仪使试管底部的细胞重悬，重复上述的离心和细胞重悬步骤两次，达到对细胞进行清洗以去除未进入细胞的重金属离子的目的。对试管中的细胞计数后用生理盐水将细胞稀释到IO5IO7个/mL，用流式细胞仪检测与含有梯度浓度重金属离子的DMEM营养液共同孵育细胞的平均荧光强度变化情况，利用荧光动态猝灭方程绘制标准曲线。向步骤3得到的培养皿中洗涤后的狗肾细胞中加入含有未知浓度重金属离子的 DMEM营养液，按上述方法在同样条件下操作，用流式细胞仪测定与未知浓度重金属离子的DMEM营养液共同孵育细胞的平均荧光强度，然后根据标准曲线就可以计算出细胞中重金属离子的浓度。所述的羧甲基壳聚糖-CdTe量子点荧光探针是由羧甲基壳聚糖和CdTe量子点在水相通过静电络合、共价结合、螯合方式自组装形成。所述的标记的细胞为狗肾细胞(由中国疾病预防控制中心提供)。所述的重金属离子包括汞、铜、银、铬、铅等能使CdTe量子点荧光产生猝灭的重金属离子。所述的检测方法是检测量子点荧光标记的细胞中的重金属离子。所述的重金属离子主要是Cr6+、U6+、Te3+、Co3+、Se6+、Pu3+、Hg2+，Mn4+ 等。 本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果本专利技术的羧甲基壳聚糖-CdTe量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法操作简便，标记后细胞的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于量子点对细胞中重金属离子原位实时检测的方法，其步骤是：A、配制0.0000025?0.001mol/L的羧甲基壳聚糖?CdTe量子点溶液，根据羧甲基壳聚糖?CdTe量子点的浓度，用移液管移取0.1~5ml的羧甲基壳聚糖?CdTe量子点溶液于灭菌的10ml容量瓶中，加入高纯水，电阻率大于?18?MΩ·cm，定容，备用；所述的羧甲基壳聚糖?CdTe量子点，制备过程是：CdCl2溶液和巯基乙酸溶液混合均匀后用NaOH?溶液调整其pH值为碱性，再向该溶液中加入新制备的KTeH4溶液，将此混合液转入聚四氟乙烯微波消解罐，放入控温的微波加热系统进行加热，反应完成后待溶液冷却至室温20?25℃，得到CdTe?量子点溶液，将该溶液通过高速离心和透析处理，去除CdTe?量子点溶液中粒径较大的CdTe量子点及反应过程中多余的Cd2+和TGA等小分子物质，得到荧光强度高，杂质含量低的CdTe量子点溶液，将CdTe?量子点与羧甲基壳聚糖溶液混合，羧甲基壳聚糖和CdTe量子点在水相通过静电络合、共价结合、螯合方式自组装，即生成羧甲基壳聚糖?CdTe量子点荧光探针；B、将T25细胞培养瓶中已长满的狗肾细胞用0.05%体积比的EDTA?胰蛋白酶消化为单细胞悬浮液，细胞计数后取1×104~1×107的狗肾细胞接种到细胞培养皿中，加入含10%体积比的胎牛血清的DMEM营养液，在37℃、5%体积比的CO2细胞培养箱中培养，使细胞正常贴壁生长繁育，得到用于实施标记的狗肾细胞；C、待步骤B狗肾细胞贴壁生长12~36小时后，向培养皿中加入羧甲基壳聚糖?CdTe量子点荧光探针，于37℃、5%体积比的CO2细胞培养箱中与细胞共同孵育6~48小时，得到带有荧光的狗肾细胞，弃去DMEM营养液，用pH=7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤2次，用荧光显微镜观察标记；D、向步骤C得到的培养皿中洗涤后的狗肾细胞中加入含有梯度浓度重金属离子的DMEM营养液，与细胞共同孵育12~72小时，弃去营养液，用EDTA?胰蛋白酶对培养皿底部的细胞进行消化，消化完全后加入1mL生理盐水吹打使细胞脱离培养皿，将该细胞悬浮液分别转入5mL试管，将试管置于离心机中，2000转/min离心5min，弃去上清液，加入生理盐水后用漩涡振荡仪使试管底部的细胞重悬，重复上述的离心和细胞重悬步骤两次，达到对细胞进行清洗以去除未进入细胞的重金属离子，对试管中的细胞计数后用生理盐水将细胞稀释到105~107个/mL，用流式细胞仪检测与含有梯度浓度重金属离子的DMEM营养液共同孵育细胞的平均荧光强度变化，利用荧光动态猝灭方程绘制标准曲线；所述的步骤C得到的培养皿中洗涤后的狗肾细胞中加入含有未知浓度重金属离子的DMEM营养液，按上述方法在同样条件下操作，用流式细胞仪测定与未知浓度重金属离子的DMEM营养液共同孵育细胞的平均荧光强度，根据标准曲线计算出细胞中重金属离子的浓度。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何振宇，周培疆，朱洪浩，刘满清，
申请(专利权)人：武汉市疾病预防控制中心，武汉大学，
类型：发明
国别省市：
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