一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基及方法技术

本发明专利技术涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明专利技术涉及一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基及方法。所述培养基的原料含有葡萄糖1-4wt%，(NH4)2SO41-4wt%，Zn2+0.5×10-4-4×10-4mol/L，VB41×10-4-1×10-3wt%，培养基初始pH=3.8-4.4。该方法通过将发酵种子液按接种于培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量1mL，玻璃珠0个，于25℃，转速160r/min下培养。本发明专利技术的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，具有漆酶产率高，漆酶活力高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本专利技术涉及。
技术介绍
漆酶(Laccase)是一种含铜多酚氧化酶，它能催化一系列有机和无机化合物发生一个电子氧化，同时伴随有氧还原成水。目前已发现多种生物能产生漆酶，包括植物、真菌、 昆虫、细菌等。其中，以真菌中的白腐菌分布最多(钞亚鹏等，2001)。漆酶具有广泛的底物作用范围，可催化多种酚类和芳香胺类化合物的氧化，降解多环芳烃。因此,在生物降解、制浆造纸中、废水处理、生物漂白、污染物脱毒、土壤修复等方面，漆酶具有重要的应用价值。目前，漆酶的研究己在多领域、多水平上展开。许多由真菌引起的植物病害中，漆酶被显示是一个重要的毒力因子。揭示虫生真菌是否能产漆酶，可为虫生真菌生防作用的深入研究提供依据。对虫生真菌漆酶的研究结果若能应用在对害虫的生物防治，无疑能更大限度地开发利用生物资源。扁座壳孢是一种重要的昆虫病原真菌,在农林害虫生物防治中具有广泛的应用前景。该菌属子囊菌门(Ascomycota)粪菌纲i^orchriomycetes) 肉座菌目(Hypocreales)麦角菌科ijOlsvicipitsceeie)座壳孢属(Aschersonia),而对扁座壳孢发酵生产漆酶国内鲜有报道，具有较大的发展前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。本专利技术首先提供了一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，所述培养基的原料含有葡萄糖 O. 5-2wt%, (NH4)2SO4 l-4wt%, Zn2+O. 5X 1(T4_4X l(T4mol/L，VB4 I X 10义1 X l(T3wt%， 培养基初始pH=3. 8-4. 4。 更优选地，所述培养基的原料按重量分数计，含有葡萄糖O. 5wt%, (NH4) 2S044wt%, Zn2+O. 5X 1(T4 mol/L, VB4 5Χ 1(Γ4 wt%,培养基初始 pH=4. 4。其次，本专利技术还提供了一种扁座壳孢发酵生产漆酶的方法，所述方法包含以下步骤(a)将扁座壳孢接种种子培养基，制得发酵种子液；(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为 50mL，接种量lmL，于25°C，转速160 r/min下培养。所述种子培养基的原料含有按培养基重量计，20% 土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏 1%，自然pH。本专利技术采用的座壳孢为扁座壳孢(何学友等，油茶黑胶粉虱及扁座壳孢对其自然控制作用，中国森林病虫，2011年7月)。采用本专利技术优化后的培养基，菌龄4d，发酵周期3d，玻璃珠O个，发酵产生结果扁座壳孢产漆酶为45U/mL以上。本专利技术的有益效果本专利技术的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，具有漆酶产率高，漆酶活力高等优点。附图说明图1不同碳源对产酶活性的影响。注图中Dex、D-Sor、Ma1、Fru、Sue、Myc、SS、Car、L-Ara, CK分别表示葡萄糖、D-山梨醇、麦芽糖、果糖、蔗糖、海藻糖、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、L-阿拉伯糖和对照组。图2不同氮源对产酶活性的影响。注图中YE、YEP、Try、PN、Cas, AS、SN、P印、Ure, CK分别表示酵母膏、酵母粉、胰蛋白胨、KNO3、干酪素、(NH4) 2S04、NaNO3、蛋白胨、尿素和 对照组。图3不同维生素对产酶活性的影响。图4不同无机盐离子对产酶活性的影响。图5不同初始pH对产酶活性的影响。具体实施例方式本专利技术用下列实施例来进一步说明本专利技术，但本专利技术的保护范围并不限于下列实施例。实施例1 单因素实验确定培养基最优成分 (I)种子培养基和基础培养基配制 (a)种子培养基20%土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏1%，自然pH。1. OlMPa，灭菌20min。(b)基础培养基20% 土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏1%，自然pH。l.OlMPa，灭菌20mino(2)发酵种子的制作将扁座壳孢接种于马铃薯琼脂培养基上，于25°C下培养5d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，25°C，转速160r/min下培养24h，即为发酵液。(3)酶液的制备取步骤(2)下的发酵液在4°C下，5000 r/min离心，15min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在在波长465nm处测定吸光值。换算成酶活单位U/mLo(4)漆酶酶活测定取O. 2mL发酵上清液加入3. 3mL醋酸缓冲液(pH4. 4)和O. 5mL4. OmmoI/L愈创木酚中(以热灭活上清液作为对照)，25°C水浴5min，冰浴加入2mL 16. 5%三氯乙酸试剂终止反应，离心后取上清液在波长465nm下测吸光度。IO6、V总....ΔΑ酶活力(U/g或UML)= - F 酶ε-- Δ 式中，X为样品的吸光度分别代表反应体系总体积及反应酶液的体积；ε为吸光系数(ε 465 =1. 21 X 10_4mol/L · cm)；以每分钟氧化底物1. O μ mo I来定义酶活。 (5)不同碳源、氮源、维生素、无机盐离子、初始pH对产漆酶的影响。(a)碳源对酶产量的影响，在基础培养基中分别添加2%葡萄糖、D-山梨醇、麦芽糖、果糖、蔗糖、海藻糖、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠和L-阿拉伯糖，接入相同的扁座壳孢菌液，在25°C、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。(b)氮源对产酶的影响，在基础培养基中分别添加1%的酵母膏、酵母粉、胰蛋白胨、KNO3、干酪素、(NH4) 2S04、NaNO3、蛋白胨和尿素，接入相同的扁座壳孢菌液，在25°C、160r/ min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。(c)维生素对酶产量的影响，在基础培养基中分别添加O. 01% VB1, VB2、Vb4、Vb6, Vc, VE、，接入等量的扁座壳孢菌液，在25°C、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。(d)无机盐离子对酶产量的影响，在基础培养基中分别添加相同摩尔数的无机盐离子(O. 4mmol NaH2PO4 · 2H20、KH2PO4、CuSO4 · 5H20、ZnSO4 · 7H20、FeCl3 · 6H20、MgSO4 · 7H20、 FeSO4 WH2CKCoCI2 ·6Η20、Μη504)，接入相同的扁座壳孢菌液，在25°C、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。(e)初始pH对酶产量的影响，用基础培养基分别提供不同酸碱度的培养环境(pH 值 3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5)，接入等量的扁座壳孢菌液，在 25°C、160r/ min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。实验结果碳源对酶产量的影响如图1所示，添加葡萄糖大幅提高了漆酶活性。在接种后第3d 就出现漆酶活性高峰，酶活性达到43. 27U/mL。添加D-山梨醇、果糖、可溶性淀粉的处理，在接种后第3d酶活分别达到14. 40U/mL、14. 43U/mL、16. 60U/mL,与对照组酶活15. 43U/mL相近；添加海藻糖、麦芽糖、羧甲基纤维素钠、蔗糖和L-阿拉伯糖的处理都对供本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料中含有葡萄糖0.5?2wt%，(NH4)2SO4?1?4wt%，Zn2+0.5×10?4?4×10?4mol/L，VB4?1×10?4?1×10?3wt%，培养基初始pH=3.8?4.4。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邱君志，苏礼超，吴宝杰，李小霞，涂洁，宋飞飞，邱云锋，郭庆丰，何肖云，毛丽慧，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：