一种基于微流控芯片的糖尿病血管病变模型的建立方法，特别针对糖尿病血管病变过程中，血管内皮炎症导致的血管壁黏附性变化特征，模拟血流条件下，单核细胞在内皮细胞表面的黏附与滚动、血栓形成及血管阻塞现象。该微流控芯片主要由细胞入口池(1)、细胞培养室(2)和出口池(3)组成，细胞培养室(2)上连细胞入口池(1)，细胞培养室(2)下连出口池(3)。可将高血糖条件下血管病变的模拟与血流条件下单核细胞与病变部位内皮细胞表面的相互作用研究集成于一体，能够同时实现糖尿病并发症中病灶部位的模拟以及血栓形成的原位模拟。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及将微流控芯片技术应用到组织仿生以及实时监测的细胞生物学研究的
，具体涉及，并应用于单核细胞在病变部位表面的运动特征的研究方法。
技术介绍
医学研究显示，有50%的心脑血管疾病是由糖尿病引起的。糖尿病人群中血管疾病患病率的增加主要原因是动脉粥样硬化的速度加快。与非糖尿病个体相比，糖尿病或糖耐量异常的个体常伴有其他代谢的异常，促进了动脉粥样硬化；同时，糖尿病增加了促凝血状态，加速了动脉粥样硬化的形成。因此，糖尿病患者发生动脉粥样硬化的年龄更早，进展成临床脑血管事件更快。糖尿病与血管病变已逐渐成为当今医学和生物学界研究的热点，目前还主要集中于细胞水平的研究。细胞并不是一个孤立的生命体，细胞与细胞之间的相互作用也不是简单的机械连接，而是存在各种形式的相互交流的。探索细胞间相互作用及相应的信号通路，对疾病治疗等有着重要作用。糖尿病与血管病变的研究发展至今，主要的研究手段仍旧依赖于孔板，集中观察单一或者多种因素刺激下细胞的形态变化、生长过程、迁移和增殖行为等。而在众多的细胞行为研究中，细胞运动作为生物体发育和形态建成等重要生命过程的基础，备受关注。细胞运动一般起始于细胞对其微环境刺激的反应，微环境刺激细胞表面受体并激活一系列的细胞内的信号转导通路，进而影响细胞间的相互作用，最终产生组织程度上的生理和病理学的变化。对于糖尿病而言，其所导致的血管病变主要为炎性黏附性增大引发的血栓和动脉粥样硬化，其过程与单核细胞在病变部位内皮细胞上的黏附与运动过程密切相关，并且在体内条件下，这一过程还要涉及到血液流动所产生的生物物理学因素。孔板实验很难在体外构建集成有流体剪切力这一生物物理学因素的糖尿病血管病变模型，所以想模拟和重现上述糖尿病所致血管病变的过程是比较困难的。微流控芯片实验室又称芯片实验室或微流控芯片，指的是把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测、细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术。微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代生物仿生和细胞研究的重要平台。目前，利用微流控芯片进行组织工程的模拟，尤其是糖尿病血管病变的模拟以及单核细胞在病变部位表面的运动特征研究分析还处于空白阶段
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，并应用于单核细胞在病变部位表面运动特征的研究，特别针对单核细胞在病变部位表面的黏附与滚动的特点，该方法具有对细胞运动实时监测的特点，同时能够实现对细胞运动速度和轨迹的准确表征。本专利技术提供了一种微流控芯片，该微流控芯片主要由细胞入口池(I)、细胞培养室(2)和出口池(3)组成，细胞培养室(2)上连细胞入口池(I)，细胞培养室(2)下连出口池⑶。本专利技术提供的微流控芯片，该微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃。所述微流控芯片的上下两层分别进行紫外过夜照射的灭菌处理，然后等离子体处理30-45S进行封接。本专利技术还提供了，基本过程如下(I)芯片修饰用移液器将配制好的胶原工作液经由细胞入口池加入芯片，将固定芯片的培养皿常温静置过夜，12-36小时(优选24小时)之内移除胶原工作液，细胞培养液冲洗通道2-4次(优选3次)，对通道底面进行修饰，促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)更好地贴壁；(2)芯片内细胞的接种与培养HUVEC细胞消化后，调整至合适的细胞密度(细胞密度为5X106cellS/mL)，经由细胞入口池加入到芯片中，在胶原的修饰作用下，细胞迅速贴壁并均匀铺展于细胞培养室底面，当在光学显微镜下观察到细胞在细胞培养室中均匀分布时，立即将芯片移入二氧化碳培养箱中继续培养；(3)糖尿病血管病变模型的建立待HUVEC细胞经过增殖完全铺满细胞培养室底面后，经由细胞入口池分别向4个通道中通入不含血清的细胞培养液并继续培养24-36小时(优选24小时)，使HUVEC细胞处于相同的生长期，随后分别依次向4个通道中通入含有不同葡萄糖浓度的细胞培养液继续48小时，模拟糖尿病患者血管壁所处的高糖环境。本专利技术建立的糖尿病血管病变模型的芯片内细胞活性考察及血管病变部位细胞表面结构与功能变化的表征，方法过程如下(I)用碘化丙啶表征培养两天后细胞的生长状态及活性；(2)常规免疫荧光染色法表征高糖作用后的HUVEC细胞内及细胞表面eNOS、vWF、ICAM-UVCAM-Uintegrin-^ 4以及粘着斑蛋白的表达(蛋白表达检测的方法为细胞免疫荧光染色)，用于表征糖尿病血管病变部位相应结构和功能的变化，主要表征细胞表面粘附性的变化。本专利技术还提供了上述建立的糖尿病血管病变模型应用于单核细胞在内皮细胞表面的黏附与滚动现象的研究，方法过程如下将培养48-72小时的白血病单核细胞稀释成I X 106-5 X 106cells/mL的细胞悬液，置入二氧化碳培养箱中备用；将不同葡萄糖浓度培养液刺激后的糖尿病血管病变模型芯片取出，经由细胞入口池以一定的流速通入单核细胞的细胞悬液，显微镜持续拍摄单核细胞在HUVEC细胞表面的黏附与滚动现象(每隔50ms拍照一张，共拍摄80张，具体实时监测时间为4s),统计发生粘附与滚动的单核细胞数目，通过Image ProPlus软件分析单核细胞运动的速度与轨迹。本专利技术提供的基于微流控芯片的糖尿病血管病变模型的建立方法，并应用于单核细胞在病变部位表面的运动特征研究，可采用生物学上常用的细胞检测手段对内皮细胞以及单核细胞进行检测，包括细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、细胞运动速度和距离的检测等。附图说明图I本专利技术微流控芯片整体结构示意图；图2本专利技术微流控芯片通道内，HUVEC细胞的贴壁与铺展情况；图3含不同葡萄糖浓度的细胞培养液刺激HUVEC细胞48h后，碘化丙啶染色表征HUVEC细胞的增殖与凋亡情况； 图4含不同葡萄糖浓度的细胞培养液刺激HUVEC细胞48h后，免疫荧光染色法检测HUVEC细胞内及细胞表面相应结构和功能蛋白的表达变化，其中，a显示的是在含不同葡萄糖浓度培养液的刺激下，HUVEC细胞表面eNOS、vWF、Int ^ 4表达量的变化，b显示的是在含不同葡萄糖浓度培养液的刺激下，HUVEC细胞表面vinculin、VCAM-l、ICAM-I表达量的变化；图5不同流体剪切力作用下单核细胞在内皮细胞表面的黏附与滚动情况，其中，a显示的是在流体剪切力FSS=O. 2dyne/cm2的条件下，单核细胞在HUVEC细胞表面的滚动与粘附现象，b显示的是在流体剪切力FSS=O. 4dyne/cm2的条件下，单核细胞在HUVEC细胞表面的滚动与粘附现象。具体实施例方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例I应用HUVEC细胞建立糖尿病血管病变模型利用实验室自行设计制作的微流控芯片，结构如图I所示。配制浓度为100 U g/mL的I型鼠尾胶原工作液，经由细胞入口池注入芯片内，常温静置过本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由细胞入口池(1)、细胞培养室(2)和出口池(3)组成；细胞培养室(2)上连细胞入口池(1)，细胞培养室(2)下连出口池(3)。
【技术特征摘要】
1.一种微流控芯片，其特征在于该微流控芯片主要由细胞入口池(I)、细胞培养室(2)和出口池(3)组成；细胞培养室(2)上连细胞入口池(I)，细胞培养室(2)下连出口池⑶。2.按照权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃。3.按照权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片的上下两层分别进行紫外过夜照射的灭菌处理，然后等离子体处理30-45S进行封接。4.一种基于权利要求I所述微流控芯片的糖尿病血管病变模型的建立方法，其特征在于方法过程如下 (1)芯片修饰 用移液器将配制好的胶原工作液经由细胞入口池加入芯片，将固定芯片的培养皿常温静置过夜，12-36小时之内移除胶原工作液，细胞培养液冲洗通道2-4次，对通道底面进行修饰，促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)更好地贴壁； (2)芯片内细胞的接种与培养 HUVEC细胞消化后，调整至合适的细胞密度，经由细胞入口池加入到芯片中，在胶原的修饰作用下，细胞迅速贴壁并均匀铺展于细胞培养室底面，当在光学显微镜下观察到细胞在细胞培养室中均匀分布时，立即将芯片移入二氧化碳培养箱中继续培养； (3)糖尿病血管病变模型的建立 待HUVEC细胞经过增殖完全铺满细胞培养室底面后，经由细胞入口池分别向4个通道中通入不含血清的细胞培养液并继续培养24-36小时，使HUVEC细胞处于相同的生长期，随后分别依次向4个通道中通入含有不同葡萄糖浓度的细胞培养液继续48小时，模拟糖尿病患者血管壁所处的高糖环境。5.按照权利要求4所述的基于微流控芯片的糖尿病血管病变模...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，许慧，马慧朋，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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