用于活化和缀合生物分子的方法技术

本发明专利技术涉及用于生成生物分子缀合物的方法，其中将该方法整合入单一单元操作中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于生成生物分子缀合物的方法，其中将该方法整合入单一单元操作(single unit operation)中。
技术介绍
随着生物技术的进展，已经开发出生物药物来满足未满足的医学需要。然而，其短的体内半衰期需要患者服用频繁和/或大剂量的这些生物药物来实现靶标治疗或预防目的。长的静脉内疗法或频繁的注射可以影响患者的生命质量。多种聚合物诸如聚乙二醇(PEG)可以与生物分子(例如，蛋白质)缀合以提高许多生物分子的半衰期和生物活性(Reddy, Ann. Pharmacother. 34:915-923，2000)。聚合物缀合物的其它益处包括(a)在制造过程期间改善的产品稳定性；(b)降低的肾清除(Fung 等，Polym. Prepr. 38:565-566, 1997);改善的肿瘤祀向(Yowell 等，Cancer Treat.Rev. 28Suppl. A: 3-6, 2002);降低的抗原性和免疫原性(Muller 等,Br. J. Haematol. I10:379-384, 2000; Abshire 等，Blood96:1709-1715，2000);和更大的可耐受性(Safra等，Ann. Oncol. 11:1029-1033，2000;Judson 等，Eur.J.Cancer 37:870-877,2001)。PEG 化已经应用于人生长因子(Kim 等，Biomaterials 23:2311-2317，2002; Wu等，Protein Expr. Purif. 48:24-27，2006)、生长激素释放因子(Piquet 等，J.Chromatogr. 944:141-148，2002)、腺病毒载体(Eto 等,Int. J. Pharm. 354:3-8，2008)和质粒 DNA (Hosseinkhani 等,J. Control Release, 97:157-171，2004)。由于 PEG 化的益处，已经开发出许多缀合反应化学(Roberts等.，Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476，2002)和聚合物衍生物(欧洲专利No. 1578841)。随着生物分子-聚合物缀合物的应用增加，有必要开发简单的、可再现的、且可缩放的(scalable)单元操作来满足制造需要。专利技术概述本专利技术涉及一种用于生成生物分子缀合物的方法，包括下列步骤通过与活化剂接触活化生物分子；除去所述活化剂；并通过将所述生物分子与活化的聚合物起反应缀合所述生物分子；其中将该方法的步骤整合入单一单元操作中。该方法可以进一步包括分开所述生物分子缀合物与未缀合的生物分子的步骤。在一个实施方案中，通过大小排阻层析或离子交换层析分开所述生物分子缀合物与未缀合的生物分子。在一个实施方案中，单一单元操作是集成的切向流过滤系统。在另一个实施方案中，活化剂选自缓冲液更换、PH调节、或还原剂。在又一个实施方案中，还原剂是二硫苏糖醇或三2-羧乙基膦(tris 2-carboxyethyl phosphine)。在其它实施方案中，聚合物是聚乙二醇，且生物分子选自蛋白质、多糖和核酸。在又一个实施方案中，所述蛋白质选自凝固因子、抗体、激素、生长因子和酶。附图简述图I :PEG化对照运行的阳离子交换层析洗脱谱(profile)。图2 :来自PEG化对照运行的阳离子交换层析洗脱峰的SDS-PAGE。图3 :来自PEG化对照的阳离子交换层析洗脱峰的大小排阻层析。图4 :以TFF模式实施的PEG化的阳离子交换层析洗脱谱。图5 :实验室规模TFF运行的阳离子交换层析洗脱谱。图6 :由实验室规模TFF运行生成的PEG化rFVI 11的SEC谱。图7 :试验(pilot)规模TFF运行的阳离 子交换层析洗脱谱。专利技术详述应当理解，本专利技术不限于所描述的具体装置或部分，并且因此可以有所变化。还应当理解，本文中所使用的术语仅为了描述具体的实施方案，而并不意图限制本专利技术的范围，其仅由所附权利要求书限制。必须注意到，如本文中和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。如此，例如，提及“药剂”指提及一种或多种药剂(agent)，并且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本专利技术所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。生物分子的缀合，诸如PEG化可以是随机缀合或位点特异性缀合物。在这两种情况中，通常活化生物分子以容许聚合物，诸如PEG的有效偶联。在随机PEG化中，PEG可以与随机活化的氨基酸残基共价缀合。它通常导致单-PEG化的和多-PEG化的生物分子的混合物。对于位点特异性PEG化，生物分子可以遗传修饰为使得PEG分子可以与生物分子的表面上的特定位点缀合。此方法使副产物形成最小化，并且减轻分开产物与副产物的随后的纯化步骤的负担。可以通过调节溶液的pH或者通过使用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三2-羧乙基膦(TCEP)活化生物分子上溶剂暴露的残基。还原后，可以经由共价连接将PEG分子附接于活化的残基。若使用还原剂，则可能有必要在缀合反应前除去还原剂。大小排阻层析(SEC)是一种用于实验室规模还原剂除去的常见技术。有效的现有技术生物分子缀合一般要求多单元操作，例如，-经由与还原剂一起温育/受控混合活化，其通常在混合式容器诸如搅拌式活化te中实施；-除去活化剂，其通常通过大小排阻层析或其它层析法进行；-经由与活化的聚合物(诸如PEG)—起温育/受控混合来缀合，其通常在搅拌式缀合te中实施；并_通过层析诸如离子交换层析分开缀合的生物分子与未反应的分子和副产物。此类方法需要多个系统和(在商业规模上)相当大的空间和单元操作间手工处理/转移。另外，SEC难以在商业规模制造中执行，并且要求设置为独立单元操作。本专利技术的方法通过利用集成切向流过滤来接触/混合及随后除去反应物将活化、除去活化剂、和缀合步骤整合入一个单一单元操作中。虽然通过利用合适的分子量截留膜保留靶生物分子，但是可以在活化/缀合之前、期间、或之后改变物理化学条件诸如浓度、pH、电导率、和缓冲液种类。系统中水动力学的调节容许调节最佳的浓度，及任选地实现膜表面上局部更高的接触浓度以进一步优化活化和缀合过程。此方法是操作简单的、可再现的、可缩放的、且可用于商业规模药物生产。可以在本专利技术的方法中使用的聚合物的例子包括但不限于聚烷撑氧(polyalkylene oxide)诸如聚乙二醇、右旋糖苷、多聚乙酰神经氨酸、或其它基于碳水化合物的聚合物、氨基酸的聚合物、生物素衍生物、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯_马来酸酸酐共聚物、聚苯乙烯-苹果酸酸酐共聚物、聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、肝素、清蛋白、纤维素、壳聚糖的水解产物、糖原、琼脂糖及其衍生物、瓜尔胶、普鲁分支葡聚糖(pulIulan)、菊粉、黄原胶(xanthan gum)、角叉藻聚糖(carrageenan)、果胶、褐藻酸水解产物及其任何等同物。聚乙二醇的例子是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。其它有用的聚烷撑二醇化合物是聚丙二醇(PPG)、聚丁二醇(PBG)、PEG-缩水甘油基醚(Epox-P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：JH沃格尔，杜志崇，CL比安科，
申请(专利权)人：拜耳医药保健有限公司，
类型：
国别省市：