一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法技术

本发明专利技术属于植物组培技术领域，提供了一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法，在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养；利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理；测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态；用荧光显微镜检测克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组织体内的定殖；该将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法采用荧光显微镜观察克雷伯氏菌标记菌株的侵染和定殖，以抗生素抗性标记法和平板分离计数法调查克雷伯氏菌标记菌株的种群动态，为具有固氮菌的健康种苗的推广应用及固氮菌与甘蔗的互作研究提供参考依据，具有较强的推广与应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物组培
，尤其涉及。
技术介绍
甘蔗健康种苗具有生长速度快、分蘖力强、成茎率高、产量高、用种量少等优点，是保证蔗糖业持续发展的重要措施之一。国家对甘蔗健康种苗的推广也非常重视。2011年，国家农业部在广西、云南、广东和海南4省(区)启动实施甘蔗健康种苗示范推广工作。世界甘蔗生产大国如巴西、古巴、美国、澳大利亚等国90%蔗区实现了甘蔗生产用种健康种植，使得甘蔗优良品种的种性得以保持，其产量和质量得到进一步提高。据报道，巴西在生产上使用健康种苗可使甘鹿增产20%-40% (个别鹿区增产高达60% ) (Urquiaga et al.,1992)。沈万宽等(2009)报道，粤糖00-236健康种苗较其普通种茎苗蔗茎产量增产10. 6% (小区试验)和9. 1% (大面积示范)，甘蔗蔗糖分提高O. 26个百分点，且萌芽快，萌芽率较普通种茎苗提高22. 94个百分点。杨本鹏等(2010)报道，种植脱毒健康种苗可以使甘蔗单位面积产量提高23. 0% 40. 2%，蔗糖分含量提高O. 51% I. 01%绝对值。甘蔗作为世界主要的糖料和能源作物，氮肥的使用量对甘蔗的生产成本影响较大，若能降低氮肥的使用量，不仅可减少甘蔗的生产投入，也可减少对环境的污染。早在60年代，Dobereiner (1966)首次从甘鹿根部发现固氮菌后,甘鹿体内的固氮微生物种类越来越丰富，如例如醋酸杆菌、成团泛菌、草螺菌、克雷伯氏菌、巴西固氮螺菌、假单胞菌等(Cavalcante et al. , 1988 ；Asis et al. ,2000 ；Govindarajan et al. , 2007 ;罗霆等，2010)。不同的甘蔗品种对接种的固氮菌的反应也不一样，有些是固氮菌种类的差别引起的，有的则是由于其基因型以及环境条件的差别引起的。甘蔗生物固氮研究表明某些甘蔗品种获得其氮素总量的30-70%左右，但是植物组织培养技术在去除一些病原微生物的同时，也会降低甘鹿体内的固氮菌数量，(Lima et al. , 1987 ；Urquiaga et al·,1992),若能在组培苗中接种固氮菌，对甘蔗健康种苗的推广计划则有更大推动作用。关于在甘蔗上接种固氮菌目前主要有两种方法，一是种茎进行浸种处理，二是对组培苗进行接种处理。接种固氮菌能不同程度提高各品种器官中细菌的固氮酶活性，巴西固氮甘蔗品种表现出比广西主栽甘蔗品种更强的固氮酶活性，且对接种固氮菌反应更敏感(林丽等，2008)欧阳雪庆等(2010)利用固氮菌液浸泡甘蔗单芽进行浸种处理，结果表明接种甘蔗内生固氮菌对甘蔗叶片硝酸还原酶活性和谷氨酰胺合成酶活性具有普遍而明显的促进作用，而对谷草转氨酶与谷丙转氨酶的影响则因甘蔗品种差异表现出不同效果。黄杏等(2009)研究报道了接种固氮菌能够提高甘蔗根系活力、蛋白质含量以及碳水化合物含量等。吴凯超等(2010)以伤口侵染法将菌液接种到甘蔗苗内发现，接种内生固氮菌可在不同程度上促进不同基因型甘蔗植株的生长，增加株高、茎径、平均节间长度和单茎重。Reis等(2006)将生根后的组培苗分成单株，用剪刀剪伤根系，50毫升MS培养基，加入O. 1ML108-19CFU/ML培养好的菌液体，培养后发现接种处理可以提高甘蔗产量和氮肥利用率。生物标记是在基因表达定位、细菌接种植物后侵染植物过程以及在植物组织中定殖观察的研究中非常有效的一种方法(Haseloff，et al.，1998)。绿色荧光蛋白(GFP)基因是从水母Aquoria victoria中克隆到的，它作为一种看得见的生物标记广泛应用到基因表达和许多不同种类有机物的蛋白质亚细胞定位，在植物与根瘤菌以及植物与内生固氮菌的研究中有较好的应用(Singh et al.，2009)。克雷伯氏菌DX120是从广西本地主栽品种新台糖22(R0C22)中分离到的一株具有高固氮活性的重要内生固氮菌，它可以在甘蔗组培苗的根中定殖并能进行固氮作用(林丽，2011)，揭示它具有较好的应用前景。本研究直接在甘蔗组培苗生根后，在液体培养基壮苗的同时，就接入一定量的固氮菌，简化了接种方法。而且研究了 DX120在不同的甘蔗品种以及接种更长时间定殖存活能力。因此我们设计了以DX120不同的菌液浓度接种两种固氮能力不同甘蔗品种(B8和GT21)的组培苗后，研究它的定殖能力，以及同一接种浓度在不同时间和不同组培苗部位的菌群动态变化，探索一种较简单的接种方法，同时比较不同菌液浓度对这两种甘蔗品种组培苗的侵染和定殖能力差异，研究结果为进一步研究该固氮菌株 与甘蔗的互作提供参考依据。
技术实现思路
本专利技术提供了，旨在解决现有技术提供的将固态氮引入到甘蔗组培苗的方法，存在引入过程复杂，成本高，效果不显著的问题。本专利技术的目的在于提供，该方法包括以下步骤在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养；利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理；测定克雷伯氏囷的标记囷株在甘庶组培苗体内的定殖动态；用荧光显微镜检测克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组织体内的定殖。进一步，所述在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养的实现方法为在无菌操作的条件下切取以上两个甘蔗品种的茎尖以上约2-4cm处的顶端分生组织接到添加3. Omgr1 2,4-D的固体MS培养基上诱导愈伤组织；在完全黑暗的条件下培养40天后再把愈伤组织接到添加2. OmgL^e-BA和O. 2mg^1NAA的固体MS培养基上进行苗分化培养；分化苗再用添加3. Omgr1NAA和2. OmgL^1IBA的固体MS培养基上诱导生根，生根后再转入添加有I. Omg^1NAA和I. OmgL^1IBA的液体MS培养基上进行壮苗培养。进一步，所述愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养时的的传代培养周期均为迎天。培养条件为白天28°C培养16小时，晚上25 V培养8小时，光照强度为2000Lx，固体MS培养基在进行12rC、20min的高压灭菌前，将pH值调到5. 8。进一步，所述利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理的实现方法为将克雷伯氏菌的标记菌株在LB液体培养基中培养，在37°C、200r/min条件下过夜培养至LB液体培养基浑浊；取10μ I菌悬液到50ml加有抗生素的LB液体培养基中，在37°C、200r/min条件下过夜培养至在600nm下的吸光度为O. 8左右；在4000 X g、10min、4°C的条件下，离心收集菌体，用无菌的pH值为7. 4的磷酸缓冲液悬浮至1012CFU/ml，再用磷酸缓冲液稀释，获得一定浓度的菌悬液；把已生根的甘蔗组培苗在超净工作台中分成单株，转到装有50ml不含维生素的1/10MS液体培养液的500ml培养瓶中，并加入一定浓度的菌悬液。进一步，所述LB液体培养基包含IOgLzl蛋白胨、5gi产酵母提取物、5gi产NaCl，并且在对LB液体培养基高压灭菌前将pH值调到7. O。进一步，所述测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态的实现方法为 取甘蔗组培苗分为根、叶鞘、和叶片三部分或根和苗两部分先在7本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养；利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理；测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态；用荧光显微镜检测克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组织体内的定殖。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李杨瑞，邢永秀，魏春燕，杨丽涛，邓智年，林丽，罗霆，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：