能够识别血凝素干区上的杂亚型中和表位的IgG同种型全长免疫球蛋白和其作为抗-流感药物的应用制造技术

本发明专利技术涉及单克隆抗体，该单克隆抗体是全长IgG-同型免疫球蛋白且其特征在于对A型流感病毒的高的宽范围中和活性并且能够识别不同A型流感病毒亚型之间的高度保守的特定血凝素表位。此外，描述了本发明专利技术的全长IgG的治疗、预防和诊断应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术总体属于免疫学领域。更具体地，本专利技术涉及能够结合并中和A型流感病毒的全长免疫球蛋白。现有技术中已知针对A型流感病毒的抗体。国际专利申请PCT/IB2009/051068描述了能够结合多个不同A型流感亚型（杂亚型免疫性（heterosubtypic immunity））的单克隆抗体，优选为Fab片段，这种抗体进一步被赋予重要的中和活性。以上提到的国际专利申请中描述的优选抗体是Fab 28片段，特征在于其包括含氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链可变区和含氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链可变区。在PCT/IB2009/051068中也描述了各自的编码核苷酸序列，即SEQ ID NO:3（重链可变区）和SEQ ID NO:4（轻链可变区）。在该说明书中，将抗体片段Fab 28指定为“Fab PN-SIA28”。在国际专利申请PCT/IB2009/051068中，作者提到专利技术的抗体对象可以可替换地作为与Fab片段相对的全长免疫球蛋白提供。已知，人的免疫球蛋白分为重链类型不同的5个主要类别：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。但是，在PCT/IB2009/051068中，未单独鉴别特定免疫球蛋白类型，并且未提供如允许本领域技术人员选择特定免疫球蛋白类型的关于重链类型的建议。此外，在PCT/IB2009/051068中，未提供关于PN-SIA28用作全长免疫球蛋白时的中和效果的实验数据。惊人地，本专利技术的专利技术人现在已发现PCT/IB2009/051068中所述的由重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列表征的单克隆抗体，尤其作为全长IgG类免疫球蛋白提供，与相应Fab片段相比，在能力和作用范围两方面，表现出对甲型流感病毒显著增加的中和活性。已知，IgG由一对轻链（L）和一对重链（C）组成。每条轻链包含两个免疫球蛋白域，一个可变（VL）域一个恒定（CL）域。重链为γ型且每条重链包含一个可变免疫球蛋白域（VH或Vγ）和三个恒定域（CH1/2/3）。γ链又可分为四个不同的亚型，分别指定为γ1、γ2、γ3和γ4。在PCT/IB2009/051068中所述的由重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列表征的作为全长IgG的单克隆抗体在下文中指定为“IgG PN-SIA28”。表1示意性地示出了由本专利技术的专利技术人获得的以对比表达的关于IgGPN-SIA28的中和活性的结果。对H3N2亚型的不同株存在显著的高中和活性的证据，而其在相应的Fab片段的情况中较低。此外，即使在极低的浓度，全长IgG对H1N1亚型的不同株表现出非常强的中和活性，高于相应Fab片段对相同的H1N1株。本专利技术的专利技术人还进行了允许评估IgG PN-SIA28也结合属于亚型H2、H5和H9的重组血凝素能力的初步实验。在实验部分中详细地描述的获得的结果允许认为IgG PN-SIA28的中和活性至少扩展至H2、H5和H9亚型，当涉及相应的Fab片段时以前没有描述该中和活性。给定IgG PN-SIA28特别的中和性，本专利技术的专利技术人还进行了允许它们鉴别构成尤其由中和抗体IgG PN-SIA28识别的表位的血凝素区的特别复杂的研究和实验（在下文中详细说明）。由IgG PN-SIA28识别的中和表位的鉴别是非常有用和重要的，使得可以进一步鉴别针对相同表位和赋予与IgG PN-SIA28实质可比的特别的中和性质的人单克隆抗体。因此，本专利技术的一个第一目的是全长IgG形式的，尤其针对A型流感病毒血红素抗原和能够结合并中和至少包括H1亚型和H3亚型的多种A型流感病毒亚型的人单克隆抗体，其特征在于抗体识别位于血凝素干区（stem region）的保守表位，所述表位包含HA1血凝素多肽的氨基酸残基His25、His45、Thr315和Asn336以及HA2血凝素多肽的氨基酸残基Thr358、Met360、Ile361或Val361、Asp362、Gly363、Trp364、Yhr384、Thr392、Val395、Glu400，氨基酸残基的编号是基于可在NCBI数据库中获得的在登录号EF467821.1的和在序列表中指定为SEQ ID NO:5的H1N1血凝素氨基酸序列。在一个优选的实施方式中，作为本专利技术的对象的全长IgG形式的人单克隆抗体能够结合并中和至少包括H1亚型、H3亚型以及H5、H2和H9中的至少一个的多种甲型流感病毒亚型。在另一优选的实施方式中，作为本专利技术的对象的全长IgG形式的人单克隆抗体能够结合并中和至少包括H1亚型、H3亚型以及H5、H2和H9亚型中的至少两个的多种甲型流感病毒亚型。在更优选的实施方式中，作为本专利技术的对象的全长IgG形式的人单克隆抗体能够结合并中和至少包括H1亚型、H3亚型、H5亚型、H2亚型和H9亚型的多种甲型流感病毒亚型。在更优选的实施方式中，作为本专利技术的对象的全长IgG形式的人单克隆抗体为IgG PN-SIA28，其特征在于其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链可变区。导致由IgG PN-SIA28抗体识别的表位的定义的研究在随后的实验部分中详细地描述。也描述了参考由现有技术的抗-流感单克隆抗体C179、CR6261和F10识别的表位进行的对比研究。由于进行的对比研究，本发明的专利技术人可证实代表一些最已知和广泛的抗-流感抗体的以上提到的现有技术抗体，可有效识别与由IgG PN-SIA28识别的表位不同的表位。以下实验部分还说明了IgG PN-SIA28的生产和进行的具有相关结果的中和实验。本专利技术的全长IgG对象，优选地，但不限于，IgG PN-SIA28，以游离的形式或以与载体结合的形式制造和使用。载体是设计成与抗体结合并修饰其药代动力学特征的任何分子或化学或生物实体，使其具有免疫原性或提高其免疫原性。载体的非限制性实例是如KLH（“钥孔帽贝血蓝蛋白”）、麻仁球蛋白、甲状腺球蛋白的蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或人血清白蛋白（HSA）的清蛋白，如绵羊红血细胞（SRBC）、破伤风类毒素、霍乱类毒素的红细胞，诸如例如聚（D-赖氨酸：D-谷氨酸）的聚氨基酸等。为了协助抗体到载体的结合，可以修饰抗体的C-末端或N-末端，例如通过引入额外的氨基酸残基，例如能够形成二硫键的一个或多个半胱氨酸残基。由于本专利技术的全长IgG对象的尤其参考IgG PN-SIA28在下面的实验部分详本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.26 IT TO2010A000237;2011.01.26 IT TO2011A01.一种特异性针对A型流感病毒血凝素抗原并且能够结合和中和至少
包括H1亚型和H3亚型的多种A型流感病毒亚型的人单克隆抗体，
其特征在于，所述人单克隆抗体为全长IgG，并且进一步的特征在
于，所述人单克隆抗体识别位于血凝素干区中的保守表位，所述表
位包括HA1血凝素亚单位的氨基酸残基His25、His45、Thr315和
Asn336和HA2血凝素亚单位的氨基酸残基Thr358、Met360、Ile361
或Val361、Asp362、Gly363、Trp364、Yhr384、Thr392、Val395和
Glu400，所述氨基酸残基的编号是基于指定为SEQ ID NO:5的
H1N1血凝素氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体能够结合
并中和至少包括H1亚型、H3亚型和H5亚型的多种A型流感病毒
亚型。
3.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体能够结合
并中和至少包括H1亚型、H3亚型和H2亚型的多种A型流感病毒
亚型。
4.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体能够结合
并中和至少包括H1亚型、H3亚型和H9亚型的多种A型流感病毒
亚型。
5.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体能够结合
并中和至少包括H1亚型、H3亚型、H5亚型和H2亚型的多种A型
流感病毒亚型。
6.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体能够结合
并中和至少包括H1亚型、H3亚型、H5亚型和H9亚型的多种A型
流感病毒亚型。
7.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体能够结合
并中和至少包括H1亚型、H3亚型、H2亚型和H9亚型的多种A型
流...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯托·布廖尼，马西莫·克莱门蒂，
申请(专利权)人：泼莫纳搜索有限公司，
类型：
国别省市：