一种快速检测端粒酶活性的试剂盒制造技术

本实用新型专利技术涉及试剂盒，特别涉及一种实时定量PCR测量样品中染色体端粒平均长度的绝对值的试剂盒。一种用RT-qPCR法测量端粒平均长度绝对值的试剂盒，其特征在于：包括盒体，衬垫，PCR反应液，Taq酶，136B4Forward，36B4Reverse，TelomereForward，TelomereReverse，84-mer，36B4片段，衬垫上设有容器空分别放置PCR反应液，Taq酶，136B4Forward，36B4Reverse，TelomereForward，TelomereReverse，84-mer。本实用新型专利技术采用试剂盒可以方便，快捷测定端粒的平均长度的绝对值，使用工业生产或检测。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

一种快速检测端粒酶活性的试剂盒
技术介绍
端粒(Telomere)是一段DNA重复序列，位于染色体末端，可以保持染色体的完整性。1990年，Harley等证实端粒的长度可以随着细胞分裂次数的增多而逐渐变短。这一发现在端粒和细胞衰老之间建立了紧密的联系。端粒重复序列的长度可能起着一种分子钟(molecular clock)的作用。不同年龄的人的体细胞的寿命明显不同,其端粒的长度也不相同。是随着年龄的增长而缩短。来自新生儿的体细胞可在体外传代培养80—90代，来自70岁老人的体细胞在体外只能传代培养20 30代，而且端粒的重复序列长度也缩短很多。端粒酶(Telomerase)是细胞中负责端粒延长的一种酶,是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定 性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短的端粒(缩短的端粒其细胞复制能力受限)，从而增强体外细胞的增殖能力。但是，在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控。实验证明，体细胞里没有端粒酶的活性，所以体细胞每分裂一次，端粒也就缩短一些。随着细胞不断地进行分裂，端粒的长度将越来越短，当达到一个临界长度时，细胞染色体会失去稳定性，使细胞不能再进行分裂而进入凋亡(apoptosis)。端粒的长度决定了细胞的寿命，因此可用丢失的端粒重复序列的长度来推测细胞有丝分裂的次数，所以端粒被称为分子钟或有丝分裂钟(mitotic clock)。端粒除了涉及到染色体稳定性,细胞的衰老和死亡外,还与肿瘤的发生密切相关。在人体内的各种细胞中，生殖细胞和干细胞染色体的末端比体细胞染色体的末端长出几千个碱基对，并且在这两类细胞里能检测到端粒酶的活性。除此之外，其他所有体细胞里都未测得端粒酶的活性。惟一的例外是来源于体细胞的恶性肿瘤细胞却又重新出现了端粒酶活性，发挥其合成端粒重复序列的功能，以补偿正常的端粒序列丢失，使端粒的重复序列不会达到导致细胞死亡的临界长度，从而获得细胞的“永生性”(immortality)。这样，恶性肿瘤细胞在体内或体外都能无限制地分裂增殖。目前，检测端粒酶活性最常用的方法是基于PCR反应的端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol, TRAP)。以人类细胞为例，这种方法使用 PCR反应扩增由端粒酶通过特定引物延长的6碱基重复序列(TTAGGG)，使该重复序列的量达到能被检测到的程度，从而间接的测定端粒酶的活性。虽然这种方法被广泛应用，但是该方法仍然有其不可忽视的缺点步骤相对复杂，耗时长，容易得到假阳性或假阴性结果等。基于以上原因，最近一些无需通过PCR反应扩增端粒重复序列而达到扩增检测信号目的的方法被开发出来，包括使用多价过核苷酸，纳米金颗粒，具有催化功能的分子信标等。但是这些技术都没有得到广泛的应用，可能的原因是这些技术的步骤仍然很复杂，与原来的TRAP方法比较，并不具备很大的优势。
技术实现思路
技术目的本专利涉及一种基于核酸外切酶III (exonuclease III)可以逐步移除双链DNA3’平末端或3’缩进末端单个核苷酸的特性，测量样品细胞内端粒酶活性的方法。一种快速检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于包括盒体，4个试剂管；所述的试剂管分别装有延伸反应混合物，标记的分子信标序列，ExoIII, Ix NEB Buffer I。所述的反应混和物成分为20mM Tris-HCl, pH 8. 3 ；1. 5 mM MgCl2 ；63 mM KCl ；O. 05% Tween 20 (w/v) ；1 mM EGTA ; 10 μ M dATP ；10 μ M dGTP ；10 μ M dCTP ； 10 μ M dUTP ；300 ηΜ延伸反应引物；0. I mg/ml BSA ;其中所述的延伸反应引物序列为5’_AAT CCG TCGAGC AGA GTT-3’ ；所述的标记的分子信标序列为5’ -(荧光基团)-HG GGT TAC TAA CCCTAA CCC TAA CCC T-(淬灭基团)-AA CCC TAA CCT TT-3’，其中斜体字母代表锁核酸LNA。所述的荧光基团包括5’6-FAM、5’ TET、5’ HEX、5’ TAMRA、5’ CY5、中间6-FAM-dT、3，6-FAM、3，TAMRA、中间 TAMRA_dT、5，R0X、3，R0X、5，Texas Red、5，Cy3、中间 Cy3、3，Cy3、3，Cy5、5，Cy5、5，Cy5. 5、5，AMCA、3，AMCA、5，J0E、3，JOE,Alexa Fluor 488、·5’ Methylene Blue、3’ Methylene Blue、FR610 ;所述的淬灭基团包括3’ BHQ _1、3’ BHQ_2、3， Dabcyl、5， Dabcyl、3， Eclipse。一种快速检测端粒酶活性的试剂盒的应用，其特征在于按步骤实现A.从细胞中提取含端粒酶的样品；B.在2 UL含端粒酶样品中分别加入48 μ L延伸反应混合物，30°C孵育I h，获得延伸产物；其中所述的延伸反应引物序列为5’ -AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’ ；C.将上述延伸产物，分别添加含Ix NEB Buffer 1,100 U ExoIII, 2 μ M标记的分子信标序列，将反应混合物置于37 0C 2 h后，使用可见光分光光度计读取结果；其中所述的标记的分子信标序列为5’ -(荧光基团)-HG GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAA CCCT-(淬灭基团)-AA CCC TAA CCT TT-3’，其中斜体字母代表锁核酸LNA。原理说明I、分子信标(MBs)与靶序列结合，产生检测信号的原理(图I)MBs是一种可特异识别核酸序列的发夹型茎环双标记寡核苷酸荧光探针，具有高特异性、高敏感性、操作简便、可用于定量分析等优点。两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。在复性温度下，因为模板存在时形成茎环结构双链解开，并与模板序列配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开，荧光基团被激发，因淬灭作用被解除，发出激发光子，从而可被检测器检测到。2、通过exonuclease III (ExoIII)移除3’端单个核苷酸,达到突光信号不断再生、增强的原理(图2):ExoIII具有从双链DNA的3' -OH末端降解生成5’ -单核苷酸的3' - 外切酶活性。该酶对双链DNA具有高度特异性，能降解平滑末端、3'缩进末端及有切口的DNA，但是不能降解3'-突出末端。利用ExoIII的特性，在与端粒酶延伸产物杂交并激活荧光基团后，MBs 3’端核苷酸被反应体系中的ExoIII逐步移除，最终使得被降解的MBs与靶序列分离，这使得靶序列能够重新与完整的MBs杂交，并激活其荧光基团。这种靶序列与MBs杂交-激活荧光基团-ExoIII降解MBs-靶序列与MBs分离的步骤不断循环，从而解决了靶序列与MBs只能以I :本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于包括盒体，4个试剂管；其中第一试剂管装有延伸反应混合物，第二试剂管装有标记的分子信标序列，第三试剂管装有ExoIII，第四试剂管装有1x？NEB？Buffer？1。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶汝章，张娟，全利，滕凌，叶亚东，朱文华，潘鹂，胡娟，郝小江，朱兆云，路易斯伊格纳罗，
申请(专利权)人：云南路易斯中药现代化工程技术研究中心，
类型：实用新型
国别省市：