本发明专利技术属于生物医学检测技术领域，具体涉及肿瘤靶向的量子点荧光探针的制备方法及其在肿瘤检测中的应用。该方法针对量子点的传统制备方法操作复杂和成本高的缺点，提供一种简单便宜的量子点水相合成技术。具体合成过程包括水溶性量子点的合成，带有巯基功能团的生物相容性修饰剂mPEG和肿瘤细胞靶向修饰剂cRGD的合成以及量子点与带有巯基的两种修饰剂的直接反应。该方法制备原料易于获取，制备过程全部为常规条件下共价修饰并且不会改变量子点和修饰剂性质，采用一步反应能同时赋予量子点体内长循环和特定细胞靶向的功能，能够有效降低成本。该方法制备的修饰后量子点粒径为5nm左右，荧光明亮，抗光致漂白性质强，具有很好的生物相容性。通过进一步调节量子点表面mPEG和cRGD的摩尔比可有效调控量子点对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的转染效率，可应用于肿瘤靶向的细胞荧光成像检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及肿瘤靶向的量子点荧光探针的制备方法及其在肿瘤检测中的应用。
技术介绍
量子点(QDs)是一种新型纳米荧光材料，具有良好的荧光发射性质，尺寸与有机染料分子相近，通过调节量子点的尺寸可以实现在同一激发波长下对不同颜色量子点的发射，且具有更优良的抗光致漂白性质，在生物医学检测领域具有很大的应用前景。目前量子点还处于研究阶段，其较低的生物相容性和组织(细胞)靶向性问题大大限制了量子点的临床应用。因此，人们正在努力寻找改善量子点毒性和提高其在特定组织或细胞中丰度的有效方法。目前的方法包括量子点与小分子、蛋白质、抗原/抗体的结合；或量子点包封于高分子 载体；或其与生物相容分子的物理混合等。其中，对量子点进行合理表面修饰是制备高生物相容性、细胞祀向的量子点探针的热点技术之一。量子点表面修饰主要通过共价连接、疏水作用、硅烷化、静电作用、螯合配位等方式，将修饰剂分子连接到QDs表面。由于生命体系中的长时间和动态的示踪和成像，要求探针在复杂的生理环境下能保持相当好的稳定性，因此，共价偶联和螯合配位修饰连接方式成为首选的量子点探针制备方法。通常采用三辛基氧化膦(TOPO)作为配体，采用金属有机合成法，也即在高温下有机金属分解成核生长形成量子点纳米粒子，再通过配体置换的方法将量子点表面的TOPO用含巯基的配体替代，得到表面具有各种功能团的量子点。特殊修饰剂的连接可通过(1)1-乙基_3-碳二亚胺(EDC)将QDs上的羧基活化，接着与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应生成活泼的酯，活泼的酯容易与伯胺分子反应，实现伯胺与羧基的共价偶联；或采用(2)丁二酰亚胺基-4-马来酰亚胺基环己烷-I-羧化酷(SMCC),在氣基和疏基之间起桥连作用，使分别含有氣基和疏基的化合物有效偶联。但是，上述量子点制备方法和表面修饰策略都存在不足。金属有机合成法对制备条件要求较高，要求无水无氧的实验条件，合成温度高(30(Γ400摄氏度)，制备需要的仪器也较为昂贵，从而导致生产成本较高。并且制备的量子点水溶性差，需要进行过程复杂的配体交换。之后的偶联反应虽经过催化剂活化，但偶联反应产率难以准确计算，且后处理复杂。然而，量子点的水相合成反应避免了以上缺点，合成可在较低温度条件下(低于110摄氏度)实现，可直接采用含巯基配体交换的方法，一步反应能同时连接生物相容性分子和具有细胞靶向性的配体，方法简单并且后处理容易，容易批量制备。这种新合成技术解决了目前传统制备方法操作复杂、后处理困难、成本高的缺点，为制备生物相容性和细胞靶向性好的量子点探针提供了极大的便利，为量子点纳米荧光探针在肿瘤靶向检测中的应用奠定基础。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是针对量子点的传统制备方法操作复杂和成本高的缺点，希望提供一种方法简单的量子点水相合成技术，实现量子点表面生物相容性分子和靶向配体分子的一步修饰，并应用于肿瘤靶向检测中。本专利技术基于生物体内具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)三肽序列的配体分子能够与肿瘤细胞及新生血管内皮细胞表面上调表达的整合素受体结合，在肿瘤的生长、侵袭和转移过程中起关键作用。研究发现，外源性的RGD三肽通过与肿瘤细胞及新生血管内皮细胞表面整合素受体的竞争性结合，可以阻止肿瘤的生长与转移。而环状RGD三肽(cRGD)比线性RGD三肽更能增加肽的稳定性、亲和力及与整合素受体结合的特异性，因此，本专利技术将cRGD三肽直接修饰于量子点表面，制备一种具有荧光特性的靶向整合素的量子点探针，应用于抗肿瘤药物系统的构建和肿瘤新生血管靶向检测研究。本专利技术的技术方案为 (l)CdTe/CdS量子点的合成 NaHTe溶液的制备在25 mL三颈瓶中加入5 mg締粉、38 mg硼氢化钠,在氮气保护下加10 mL去离子水，磁力搅拌，控温80°C，反应30分钟，反应最终溶液为紫红色液体。 CdTe核的制备在250 mL三颈瓶中加入183 mg氯化镉，160 mL去离子水，112 μ L巯基乙酸，搅拌，滴加I mol/L氢氧化钠至溶液pH为10，在氮气保护下趁热加入4 mL上述NaHTe溶液，控温100°C，搅拌若干小时，冷却至室温。CdTe/CdS的制备在制备好的CdTe核中加入224 μ L巯基乙酸，滴加I mol/L氢氧化钠至溶液PH为10，氮气保护，100°C控温反应I小时。旋转蒸发浓缩至25 mL，加等体积冰冻异丙醇，搅拌，离心收集固体(5000 rpm, 5min)，即得CdTe/CdS量子点。(2)聚乙二醇单甲醚硫辛酸酯(mPEG-TA)的制备 将硫辛酸 TA (3. 09 g，15 mmol)、聚乙二醇单甲醚 mPEG35(l (3. 5 g，10 mmol), N, N —二环己基碳二亚胺DCC (3. 09 g，15 mmol)、对二甲氛基批P定DMAP (0.122 g, I. 00 mmol)溶于60 mL 二氯甲烷中，室温搅拌24小时。抽滤，滤液浓缩，饱和碳酸钠溶解，乙酸乙酯萃取3次，有机层合并，适量无水硫酸钠干燥。抽滤后浓缩黄色液体，经柱层析(二氯甲烷甲醇=30:1)得到黄色液体 mPEG35(l-TA 4.42 g。此法同样适用于聚乙二醇单甲醚55(|硫辛酸酯OiiPEG55ci-TA)和聚乙二醇单甲醚75(|硫辛酸酯(mPEG75Q-TA)的合成。(3)聚乙二醇单甲醚硫辛酸酯和/或环状RGD肽对量子点的表面修饰 将0. 17 mmol mPEG-TA溶于2 mL甲醇中，在O °C搅拌条件下加入I. 5倍摩尔量的硼氢化钠水溶液(I mg/mL)，继续搅拌I h，采用I mol/mL盐酸调节pH值约为6。在该溶液中加入预先用三(2 -羧乙基)膦盐酸(TCEP)处理的cRGD肽，使mPEG和cRGD的摩尔比例分别为 3: 0,3: 1,3: 3,1 3 和 0: 3 (可分别表示为 QDs-mPEG, QDs-mPEG/cRGD0 25,QDs-mPEG/cRGD0 5, QDs-mPEG/cRGD。.75，and QDs-cRGD)。然后，在溶液中加入 10 mg量子点，室温温和搅拌I h。采用截留分子量为3 500 Da的透析袋在去离子水中透析24 h，冻干，获得具有不同聚乙二醇和小肽摩尔比的棕色粘稠物质(QDs-mPEGx/cRGDy)。(4)细胞摄取实验 采用整合素受体表达高的人类乳腺癌MDA-MB-231作为模型细胞株，探讨不同表面修饰量子点的细胞摄取情况。MDA-MB-231细胞在含10% (V/V)胎牛血清的DMEM培养基中培养。培养箱条件为37°C，含有5% CO2。当MDA-MB-231细胞生长至汇合度80%，将经0. 22微米的无菌过滤器过滤的量子点及其表面修饰衍生物溶液加入细胞培养基中，最终浓度为40 ug/mL。采用激光共聚焦扫描显微镜对量子点的细胞摄取特性进行分析。激发波长为365 nm，检测波长为650 nm，放大倍率为1000。采用有机金属热解方法制备的量子点在应用于细胞或生物体检测之前，通常需要使用双亲性的胶束并通过胶束疏水相互作用将量子点疏水表面转化成亲水表面，再采用化学方法连接细胞靶向分子，这一方法增大了量子点的粒径。相对于现本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肿瘤靶向量子点荧光探针，其特征是由三部分组成：（1）量子点内核为具有壳？核结构的荧光纳米粒子如CdSe/CdS或CdTe/CdS或CdTe/ZnS；（2）长循环修饰剂为聚乙二醇系列衍生物；（3）靶向修饰剂为具有巯基的肿瘤靶向系列配体如RGD肽、叶酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈江宁，丁娅，张峻峰，陈梦婕，尤宸超，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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