本发明专利技术涉及直接重新接种收集的在中空纤维生物反应器中生长的贴壁细胞的方法。本发明专利技术还公开了一种用于将贴壁细胞直接重新接种在中空纤维生物反应器中的收集培养基。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】优先权本专利申请要求于2010年5月5日提交的临时专利申请61/331，660的优先权，且本专利申请是于2008年3月5日提交的美国专利申请12/042，763的部分接续申请。
技术介绍
在多种处理和治疗中，干细胞的使用正受到越来越多的关注。干细胞可被用于修复或替代受损或有缺陷的组织，且具有治疗大范围疾病的广泛的临床应用。细胞扩增系统可用于使干细胞以及其它类型的细胞(贴壁细胞和非贴壁细胞)生长。在细胞将要生长和分裂前，贴壁细胞需要贴附的表面。而非贴壁细胞在悬浮液中漂浮的同时进行生长和分裂。 细胞扩增系统为生长的细胞提供营养物且移除代谢物，以及供应有助于细胞生长的生理化学环境。细胞扩增系统在本领域是已知的。生物反应器或细胞生长腔体作为细胞扩增系统的组件在为扩增的细胞提供最优化环境中起到重要作用。在本领域中已知很多类型的生物反应器。生物反应器装置包括培养瓶、转瓶(roller bottle)、振荡瓶(shaker flask)、搅拌槽式反应器(stirred_tankreactor)、气升式反应器(air-lift reactor)和中空纤维生物反应器。—旦生物反应器中扩增的细胞达到细胞覆盖或期望的细胞数量，则需要收集细胞，且如果期望进ー步的细胞生长，则需要将细胞重新接种在相同或不同的生物反应器中。不管使用何种类型的生物反应器装置，为了收集贴壁细胞，必须首先从细胞生长的表面上移除细胞。为了从生长表面移除贴壁细胞，初始清洗细胞以移除抑制胰蛋白酶的离子(镁、钙)。然后将胰蛋白酶添加至经清洗的细胞以使细胞从表面松落。一旦细胞被松落，则从膜表面移除它们，且通过清洗被移除的细胞或使它们旋转沉淀为细胞团、移除周围的流体且将它们悬浮在新的生长培养基中进行处理以移除胰蛋白酶。该程序容易在细胞生长在平板上的开放系统(诸如培养瓶)中进行，其中该程序在层流净化罩中进行。但是在使用中空纤维生物反应器的封闭系统中，该系统对大气是封闭的。没有简单的方法来添加流体或从系统中移除流体，且包含在细胞生长所需的生长培养基中的离子由于通过中空纤维的超滤而从细胞生长空间中丢失。因此细胞存活在被稀释的培养基(来自从细胞初始清洗进入系统的添加的流体)、胰蛋白酶(来自用于使细胞从膜松落的胰蛋白酶)、且由于超滤培养基中没有离子(例如钙和镁)围绕的环境中。这些因素可造成被直接重新接种在中空纤维生物反应器中的收集的贴壁细胞的细胞生长不足。因此，需要开发新的重新接种的方案以在使用中空纤维生物反应器的细胞扩增系统中使用
技术实现思路
本专利技术涉及用于直接重新接种收集的在中空纤维生物反应器中生长的贴壁细胞的方法，所述中空纤维生物反应器具有内毛细管空间(intracapillary space)和外毛细管空间(extracapillary space),其中细胞生长空间是内毛细管空间或外毛细管空间中的一种。该方法包括以下步骤从所述细胞生长空间移除生长培养基；清洗所述细胞以从所述细胞生长空间移除残留的生长培养基；通过将胰蛋白酶添加至所述细胞生长空间，使所述细胞从中空纤维生物反应器的中空纤维上松落；从所述细胞生长空间移除细胞和所有胰蛋白酶；使来自被移除的细胞中的胰蛋白酶失活；以及，将被移除的细胞和胰蛋白酶直接重新接种在中空纤维生物反应器的细胞生长空间中。本专利技术还要求了一种制造收集培养基的方法，所述方法通过使用Chvh+Ov0K =CfVh+Cc;V。计算培养基中需要的离子和蛋白质的量，且将计算出的量的离子和蛋白质加入培养基中，以在将贴壁细胞直接重新接种在中空纤维生物反应器中使用。附图说明图I为在本专利技术中有用的中空纤维生物反应器的示例图。 图2示出了可被本专利技术使用的细胞扩增系统的示例图。图3是在根据本专利技术完整重新接种的程序之前、过程中及之后的代谢浓度的示图。具体实施例方式本申请大体涉及用于收集和/或重新接种来自封闭细胞扩增系统的中空纤维细胞生长腔体/生物反应器的贴壁细胞(尤其为间充质干细胞)的无菌方法。封闭系统指该系统没有直接暴露于大气。从细胞扩增系统收集扩增的细胞包括从生物反应器中移除所有扩增的细胞。重新接种收集到的细胞包括将所有被移除的细胞重新装载在相同或不同的生物反应器中以用于进ー步扩增；或，将收集到的细胞的一部分重新装载在相同或不同的生物反应器中，同时保留被移除细胞的剰余部分用于随后的应用。现在參考图1，在正面立视图中示出了可被本专利技术使用的中空纤维细胞生长腔体100的实例。细胞生长腔体100具有纵向轴LA-LA，且包括细胞生长腔体的壳体104。在至少ー个实施方式中，细胞生长腔体的壳体104包括四个开孔(opening)或端ロ(port) IC入口 108、IC出口 120、EC入口 128和EC出口 132。应注意在附图中，相同的元件由相同的标记表示。箭头示出了流体流过生物反应器100 (图I)和细胞扩增系统200 (图2)的方向。多个中空纤维116被配置在细胞生长腔体的壳体104内。用于制造中空纤维116的材料可以是能够被制成中空纤维的任何生物相容的聚合材料。术语“中空纤維”、“中空纤维毛细管”和“毛细管”可互換使用。多个中空纤维被称为膜。中空纤维116的末端可通过连接材料(本文中还被称为“灌封料(potting) ”或“灌封材料”)被灌封至细胞生长腔体的壳体104的末端。灌封料可为用于粘合中空纤维116的任何适当的材料，但条件是不阻塞培养基(和如果期望的细胞)进入中空纤维的流动。示例性的灌封材料包括(但并不限于)聚氨酯或其它适当的粘合或粘附组分。端盖112和124被分别配置在传质装置(mass transferdevice)的姆一端。第一循环路径202 (见图2)中的细胞生长培养基通过在细胞生长腔体100的第一纵向末端112处的IC入口 108穿入细胞生长腔体100，进入且穿过中空纤维116的毛细管内侧(在各实施方式中被称为毛细管内(“1C”)侧或“ IC空间”)，且通过位于细胞生长腔体100的第二纵向末端124的IC出口 120穿出细胞生长腔体100。在IC入口 108和IC出ロ 120之间的流体路径限定了细胞生长腔体100的IC部分126。第二循环路径204(见图2)中的流体通过EC入口 128流入细胞生长腔体100，与中空纤维116的毛细管外侧或外部(被称为“EC侧”或“ EC空间”)接触，且经由EC出口132离开细胞生长腔体100。EC入口 128和EC出口 132之间的流体路径包括细胞生长腔体100的EC部分136。经由EC入口 128进入细胞生长腔体的流体与中空纤维116的外部接触。小分子(例如离子、水、氧气、乳酸盐等)可通过中空纤维从IC空间扩散至EC空间，或从EC空间扩散至IC空间。大分子量的分子(诸如生长因子)通常太大而不能穿过 中空纤维膜，因此留在中空纤维的IC空间中。可根据需要替换培养基。培养基还可通过气 体转移组件/氧合器232进行循环以根据需要交换气体。在不背离本专利技术的精神和范围的情况下，细胞通常被容纳在第一循环路径202中的中空纤维的IC空间内，但还可被容纳在第二循环路径204中的EC空间内。不管细胞生长在IC空间还是生长在EC空间中，细胞均生长在细胞生长空间中。用于制造中空纤维膜的材料可为能够被制成中空纤维的任何生物相容的聚合本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：格伦·德尔贝特·安特韦勒，大卫·A·温德米勒，莫尼克·吉文斯，
申请(专利权)人：泰尔茂比司特公司，
类型：
国别省市：
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