排除假阴性的PCR 检测方法和其中使用的引物技术

本发明专利技术提供一种在微生物混入制品等时不进行假阴性判定而采用PCR法就能准确检测的PCR检测系统。本发明专利技术提供一种微生物检测方法，所述微生物检测方法包括：应用用于扩增样品中可能存在的微生物的靶基因序列的第1引物对以及用于扩增上述样品中的阳性对照基因序列的第2引物对进行PCR反应，其中，上述PCR反应中的上述靶基因的检测灵敏度和上述阳性对照基因的检测灵敏度是同等的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种基于PCR法的微生物检测方法。特别是，本专利技术涉及一种微生物检测方法，其采用针对作为检测对象的微生物中的特异基因而设计的引物进行PCR反应并根据PCR产物的有无定性地判定微生物是否存在。
技术介绍
就啤酒制品等样品而言，进行微生物检测在担保品质方面是非常重要的。作为样品中可能存在的微生物的检测方法，已知有几种方法。采用PCR进行判定为样品中的有害微生物的检测法之一，其作为简便、迅速而且准确的方法广泛应用于啤酒、其他食品等样品中的微生物检测中。利用了 PCR的检测方法中，为了提高检测的灵敏度和特异性，研究了例 如浓缩样品、使用特异性高的探针或者引物、组合多个探针或者引物、提高基因提取的效率等。具体而言，已知有通过在引起食物中毒的菌种的菌种鉴定方法中组合使用多个特异的探针来回避假阳性和假阴性的方法(文献I);在军团菌属的检测方法中通过在浓缩样品以及基因的提取方法方面下功夫而提高靶基因的提取效率、回避假阴性的方法(文献2);在S. pastrianus的基于LAMP法的检测方法中，通过使用近亲菌种中没有的特异性高的引物提闻检测灵敏度以及精度的方法(文献3)等。
技术实现思路
通过PCR进行微生物检测时，为了确认从微生物试样中确实提取出基因组DNA，有时对管家基因(例如细菌的16S rDNA、酵母的26S rDNA)也进行PCR反应。由于管家基因与通常的基因相比拷贝数多，用提取自同一试样的基因组DNA进行靶基因以及管家基因的PCR时，如果从菌体提取的DNA浓度低，有时只有管家基因能被检测出。结果，即便制品等中混入了有害微生物也会判定为阴性，致使品质管理方面产生问题。因此，必须构建该微生物混入制品等时不进行假阴性判定而采用PCR法就能准确检测的PCR检测系统。因此，期望的是将应该检测出的对象基因的检测灵敏度和用于确认从菌体中的DNA提取的管家基因的检测灵敏度设为同等。本专利技术是一种微生物检测方法，所述微生物检测方法包括应用用于扩增样品中可能存在的应该检测出的微生物的靶基因序列的第I引物对以及用于扩增上述样品中的阳性对照基因序列的第2引物对进行PCR反应，在上述阳性对照基因序列被扩增而上述靶基因序列不被扩增时判定为上述微生物不存在，在上述阳性对照基因序列被扩增而且上述靶基因序列也被扩增时判定为上述微生物存在；其中，上述PCR反应中的上述靶基因的检测灵敏度和上述阳性对照基因的检测灵敏度是同等的。更具体而言，本专利技术为上述方法，其中，第I引物对中的至少I个引物中相对于靶基因序列的互补序列存在变异、和/或第2引物对中的至少I个引物中相对于阳性对照基因序列的互补序列存在变异；优选存在核苷酸向引物的插入。特别是，本专利技术为上述方法，其中，样品中可能存在的应该检测出的微生物为糖化酵母，靶基因为STA1，阳性对照基因为酵母的26S rDNA。更具体而言，本专利技术为上述专利技术，其中，第I引物对为如下的一对引物包含序列号I的序列的引物以及包含序列号3的序列的引物；和/或第2引物对为如下的一对引物包含序列号4的序列的引物以及包含序列号5的序列的引物。另外，本专利技术为一种引物组，所述引物组包含用于扩增样品中可能存在的微生物的靶基因序列的第I引物对、以及用于扩增上述样品中的阳性对照基因序列的第2引物对；同一 PCR反应条件下上述靶基因的检测灵敏度和上述阳性对照基因的检测灵敏度是同等的。更具体而言，本专利技术为上述上述引物组，其中，上述第I引物对中的至少I个引物中相对于靶基因序列的互补序列存在变异；和/或第2引物对中的至少I个引物中相对于阳性对照基因序列的互补序列存在变异，优选存在核苷酸向引物的插入。 特别是，本专利技术也为上述专利技术，其中，第I引物对为如下的一对引物包含序列号I的序列的引物以及包含序列号3的序列的引物；和/或第2弓丨物对为如下的一对弓丨物包含序列号4的序列的引物以及包含序列号5的序列的引物。附图说明图I表示糖化酵母(S. diastaticus) (A)和酿酒酵母(S. cerevisiae) (B)中的葡糖淀粉酶基因(STAl)的构造差异，以及对应STAl基因扩增用引物(F4和R6)的区域。另夕卜，图I中表示，糖化酵母的STAl具有酿酒酵母的S2、S1和SGA的一部分融合而成的构造。F4、F6分别表示实施例I中使用的引物STA1-F4、STA1-R6的位置。图2表示使用与模板完全互补的引物扩增阳性对照基因序列和靶基因序列时(A)、以及使用包含与模板序列错配的引物扩增对照基因序列和靶基因序列时(B)的扩增结果。(A)、(B)中，条带I和5表示将样品原液供于PCR时扩增而得的DNA片段，条带2和6表示将样品10倍稀释液供于PCR时扩增而得的DNA片段，条带3和7表示将样品100倍稀释液供于PCR时扩增而得的DNA片段，条带4和8表示将样品1000倍稀释液供于PCR时扩增而得的DNA片段。条带I 4表示阳性对照基因26S rDNA的扩增结果，条带5 8表示靶基因STAl的扩增结果。用于解决问题的方案本专利技术的具体的一方式为如下方法进行包含从样品(例如通过琼脂培养基的培养从制品中分离的菌种的菌落)中的DNA提取、使用针对作为检测对象的微生物特有的基因设计的引物的PCR、紧接着的PCR反应产物的电泳的一连串操作，以上述PCR有无扩增产物为基准，定性地判定有无微生物的混入。本专利技术包含使用用于扩增样品中可能存在的应该检测出的微生物的靶基因序列的第I引物对、以及用于扩增上述样品中的阳性对照基因序列的第2引物对分别进行PCR反应。本专利技术中，上述阳性对照基因为微生物基因时，上述样品中可能存在的应该检测出的微生物和保有上述阳性对照基因的微生物通常不同，但是也可以相同。另外，上述样品中可能存在的应该检测出的微生物和保有上述阳性对照基因的微生物即便不同，两微生物为近缘种时或阳性对照基因的种间保守性较高时，上述阳性对照基因的序列与应该检测出的微生物的对应基因的序列有时也相同。上述样品中的阳性对照基因序列和用于扩增上述对象基因序列的第2引物对可以选择已经确认了在一定条件下进行PCR时有扩增产物生成的序列和引物对。例如样品为啤酒时，上述阳性对照基因优选从用于啤酒酿造的酵母的管家基因中选择，根据样品的性质，也可以使用包含细菌、曲霉在内的菌类等的管家基因等。适合作为本专利技术的阳性对照基因的管家基因，包括细菌的16S rDNA、酵母的18S rDNA、26S rDNA、act I以及GAPDH，但不限定于这些。能够根据本专利技术来检测的微生物包括酵母，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Saccharomycespastrianus、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、Pichiajadinii、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)、异常德克拉酵母(Dekkera anomala)>Dekkera bruxellensis、德尔布有抱圆酵母(Torulasporadelbrueckii )、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、Candidaishiwadae> Shizosaccharomyces pomb本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：下津智志，铃木康司，
申请(专利权)人：朝日啤酒株式会社，
类型：
国别省市：