使用参考封闭序列的全COLD-PCR富集制造技术

本发明专利技术涉及用于富集样品中低丰度等位基因的方法、组合物和软件。具体来说是涉及在扩增反应混合物中使用过量的参考封闭序列以改进全COLD-PCR的富集效率并减少其循环时间。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对核酸样品中低丰度靶序列(例如突变)的扩增和富集的改进。具体来说，本专利技术涉及在全COLD-PCR(在较的变性温度下共扩增)过程中使用参考封闭序列。
技术介绍
在遗传分析中经常遇到的情况表明需要在存在大量过量的非变体序列(“参考序列”)下鉴定低百分比的变体DNA序列(“靶序列” )。这种情况的实例包括(a)在存在大量过量的正常等位基因下鉴定及测序几个突变的等位基因；(b)表观遗传分析中在存在大量过量的非甲基化等位基因下鉴定几个甲基化的等位基因(或反之亦然)；(c)在线粒体DNA中检测低水平的异质性；(d)在病毒感染中检测耐药性类物种和(e)在存在大量过量的野生型等位基因下鉴定癌症患者血液中的肿瘤循环DNA(其中该人疑似患有癌症，以跟踪癌症治疗的成功或检测复发)。本申请的专利技术人之前已描述用于富集样品PCR反应混合物中的低丰度等位基因的浓度的COLD-PCR方法；见由Gerassimos Makrigiorgos转让给本专利技术受让人的题为“革巴序列的富集”的公开PCT专利申请(其国际申请号为PCT/US2008/009248，现在为美国编号12/671295)。所描述的COLD-PCR富集方法基于修改的核酸扩增方案，其在临界变性温度“Tc”下孵育反应混合物。之前的专利申请公开了两种形式的C0LD-PCR，即全COLD-PCR和快速 COLD-PCR。在全COLD-PCR中，使所述反应混合物处于第一变性温度(例如94°C )，与传统PCR类似地选择足够高于参考(例如野生型)序列和靶(例如突变体)序列的解链温度的变性温度。然后缓慢地冷却所述混合物以便于通过杂交形成参考-靶异源双链体。通常以受控的方式在超过8分钟的时间稳定地从94°C至70°C降低温度以确保正确的杂交。或者，迅速地降低温度至70°C并保持在该温度下8分钟以确保正确的杂交。一旦冷却，所述反应混合物不仅含有参考-靶异源双链体，也含有参考-参考同源双链体(和更少程度的靶-靶同源双链)。当所述靶序列和参考序列交叉杂交时，沿短的(例如<200bp)双链DNA序列的任何地方的一或多种单核苷酸错配或插入或缺失的微小的序列差异会产生该序列的解链温度(Tm)的小的但可预测的变化(Lipsky,R. H.等人(2001)Clin Chem, 47, 635-644 ；Liew,M.等人(2004)Clin Chem, 50，1156-1164)。取决于确切的序列上下文和错配的位置，O. 1_20°C的解链温度的变化都是可考虑的。上述所提及的专利申请中所描述的全C0LD-PCR，前提是在双链参考序列和杂交参考-靶异源双链体之间的解链温度上的差异。在冷却下来形成参考-靶异源双链体后，在临界变性温度(Tc)下孵育所述反应混合物，临界变性温度选择为低于双链参考序列的解链温度并高于参考-靶异源双链体的较低的解链温度，从而交叉杂交的异源靶-参考异源双链体的变性优先于参考-参考同源双链。临界变性温度(Tc)是在低于该温度下所述参考核酸序列的PCR效率急剧下降的温度(但不足以促进参考-靶异源双链体的变性)。例如，如果设定PCR变性温度在87V，167bp的p53基因序列扩增良好，在86. 5°C扩增一般而如果PCR变性设置在86°C或以下时检测不到产物。因此，在本实施例中Te—86.5Γ。在临界变性温度(Tc)下的中间孵育后，所述引物退火至来自变性异源双链体的变性的靶和参考链并由聚合酶延伸，从而相对于参考序列富集靶序列的浓度。全COLD-PCR优点之一是靶序列和参考序列使用同一引物对。上述提及的专利申请中所描述的快速C0LD-PCR，前提是双链参考序列(例如野生型序列)和双链靶序列(例如突变体序列)的解链温度之间有差异。具体来说，所述靶序列的解链温度必须低于所述参考序列的解链温度。快速COLD-PCR中的临界变性温度(Tc)是在低于该温度下所述双链参考核酸序列的PCR效率急剧下降，但不足以促进双链靶序列的变性的温度。在所述快速COLD-PCR富集循环期间，所述反应混合物不经历在全COLD-PCR循环的第一步骤中的高于所述参考序列的解链温度(例如94°C)的变性。相反，在临界变性温度(例如Tc=83. 5°C )孵育所述反应混合物，选择该温度(a)低于双链参考序列的解链温度并高于双链靶序列的较低的解链温度，或(b)低于参考序列和靶序列的Tm，但仍然造成参考序列和靶序列变性程度的差异。在临界变性温度(Tc)下孵育后，所述引物退火至变性的靶链并由聚合酶延伸，从而相对于参考序列富集靶序列的浓度。同一引物对也都用于靶序列和参考序列。 已发现与通过快速COLD-PCR的富集相比，通过全COLD-PCR的富集相对地效率差并且耗时。然而，快速COLD-PCR的使用限于所述双链靶序列的解链温度适合地低于所述双链参考序列的解链温度的应用中。例如，如果所述突变体序列的解链温度是等于或高于野生型序列的解链温度，在已进行快速COLD-PCR的有低丰度突变体序列的样品的测序数据中不会检测到突变。因此，有需求改进所述全COLD-PCR循环的效力和速率。认为全COLD-PCR的相对的效率差主要是由于异源双链体的缺乏，特别是在全COLD-PCR早期循环期间形成的异源双链体的缺乏。即使优化在杂交步骤期间的缓慢冷却(例如，从94°C至70°C稳定地冷却8分钟)，非常低浓度的靶(例如突变体)链(尤其在早期循环期间的)减少形成异源双链体的能力。增加杂交冷却的时间是不期望的，并且在任何情况下未发现对改进富集特别有效。全COLD-PCR可能比快速COLD-PCR相对低效率的另一原因是在全COLD-PCR的后期循环期间的扩增子具有重新形成其同源双链体而不是形成异源双链体的倾向。本专利技术的一个目的是提高在全COLD-PCR的早期循环中的异源双链体形成的效率。本专利技术的另一目的是降低全COLD-PCR的总循环时间。专利技术概述本专利技术是用于富集样品中的低丰度等位基因的方法，并特别涉及在所述反应混合物中使用过量的参考封闭序列以提高全COLD-PCR的效率并缩短循环时间。本专利技术涉及在以上提及的Gerassimos Makrigiorgos的受让给本专利技术受让人的题为“靶序列的富集”专利申请(国际申请号为PCT/US2008/009248，现在为美国编号12/671295)中结合图I和2所描述的COLD-PCR方法的修改，该申请在此通过引用并入本文。更具体地，根据本专利技术，每个修改的全COLD-PCR方案在所述反应混合物进行热循环之前向所述反应混合物中过量地添加设计的参考封闭序列(例如单链寡核苷酸)。所述修改的全COLD-PCR方法涉及制备含有核酸样品的扩增反应混合物。所述核酸样品会具有参考序列(例如野生型序列)并也会疑似含有一或多种靶序列(例如一或多种突变体序列)。如所提及的，本专利技术的目的是富集所述靶序列的浓度，从而在大多数情况下，当所述靶序列如果存在并且是低丰度时会使用该方法。根据本专利技术的靶序列与所述参考序列具有至少50%同源性，不过该方法特别地适合于富集含有大约1-10个碱基序列变化的突变体等位基因。使用与用于所述参考序列的同样的引物通过PCR扩增所述靶序列。如所提及的，本专利技术涉及在所述反应混合物中存在过量浓度水本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·马克里吉奥古斯，
申请(专利权)人：达纳法伯癌症研究院有限公司，
类型：
国别省市：