本发明专利技术的目的在于提供一种具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1及其制备方法和应用，通过分泌表达的方式大量生产获得重组textilinin-1，其具有较高的抑制plasmin的生物活性。该重组textilinin-1可以作为止血药，用于手术过程中纤维蛋白被纤溶酶溶解导致的失血过多。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种基因重组方法制备具有抗纤溶酶活性的多肽textilinin-Ι。其关键是textilinin-1 (Q8008)基因的密码子优化、合成、克隆、表达及产物的发酵表达和分离纯化制备。重组textilinin-Ι可以作为止血药，用于控制手术过程中纤维蛋白被纤溶酶溶解导致的失血过多。
技术介绍
临床上，外科手术中如何減少血液的流失是需要密切关注的重要事件，尤其是对手术时间较长的心肺旁路手术，就更应该采取一定的措施，避免和減少患者的大量出血。減少外 科手术中血液的用量能有效地降低因输血产生的大量问题和避免经血液传播疾病的感染，如こ型肝炎病毒，人免疫缺陷型病毒(HIV)和变型的克罗伊茨费尔特-雅各布病等。止血药aprotinin (抑酞酶)在国外被常用于心脏外科手术中，主要用于体外循环下实施冠状动脉旁路移植术(CABG)的病人，以减少手术过程中的出血，并相应降低输血需求。但aprotinin有明显的副作用，可产生严重的不良反应，主要包括过敏性休克、心肌缺血、血栓形成、心カ衰竭、肾功能异常、急性肾衰竭等，目前已经停止使用。目前在国内还没有发现有同类产品的研究和报告。澳大利亚研究的textilinin-1仍处于实验室研究阶段。初步试验结果证明textilinin-l与aprotinin相比,在相同用量的情况下，其止血过程更安全可靠。textilinin-1 (Txln-1),是一种Kunitz-型蛋白酶抑制剂，是从澳大利亚棕蛇Pseudonaja textilis textilis中提取的,具有59个氨基酸,分子量为6. 7 kDa的多肽。这个分子被建议作为在外科手术中aprotinin的替代药物。虽然textilinin-Ι与aprotinin在蛋白序列上相似度只有47%。但在这两种多肽中，六对ニ硫键是高度保守的。因此，预期他们的分子空间折叠是相似的，只是分子表面特性有些不同。textilinin-Ι 和 aprotinin 都具有强烈地抑制 plasmin、elastase 和 trysin 活性的作用。石开究发现 aprotinin 对 urokinase, thrombin 和 kallikrein t匕 textilinin—l强。被textilinin-Ι抑制的plasmin将很快地被逆转，并比aprotinin易于控制,这可有助于控制血浆和损伤部位的抗纤维蛋白溶解活性。textilinin-Ι的这ー特点降低了由于強烈抑制纤溶酶(aprotinin)而导致的血栓风险，使它成为減少手术中血液损失的安全治疗性药物。并且，由于textilinin-Ι相对于plasmin有更强的专一'丨生，可以在较高的剂量使用而没有由于酶特异性差而导致的安全风险。与主要用于心脏外科手术中aprotinin相比，Textilinin-I可能作为更可靠和更安全的止血用药。textilinin-Ι可引起预期的血块溶解抑制作用。在同样的摩尔浓度下，aprotinin的抑制作用显著低于textilinin-Ι。这也是早期用血衆凝块溶解实验所证明的。textilinin-Ι可抑制纤溶酶活性，并在小动物模型中能减少出血。textilinin-Ι同aprotinin ー样,在5微摩的浓度下就能产生几乎完全抑制tPA诱导产生的全血凝块纤维蛋白的溶解。aprotinin能显著增加血衆aPTT,而血衆aPTT则不受textilinin-Ι的影响。在小鼠尾静脉出血动物模型中，静脉给药，textilinin-Ι和aprotinin都能起到相同的减少血液损失的作用。但textilinin-Ι可使小鼠止血时间更短。说明textilinin-Ι值得进ー步研究，有望开发成为替代aprotinin的药物。蛇毒中提取的Textilinin-Ι为59个氨基酸的多肽，含有三对分子内ニ硫键，其天然核酸和氨基酸序列如下I MG GAC CGT CCG GAT TTC TGT GM CTG CCT GCT GAC ACCGGA CCA 45 I KDR P DF CEL PA DTGP 15 46 TGT AGA GTC AGA TTC CCA TCC TTC TAC TAC AAC CCA GAT GAA AM 9016 CRV RF PS FYY NP DEK 30 91AAG TGC CTA GAG TTT ATT TAT GGT GGA TGC GAA GGG AAT GCT AAC 135 31 K CL EFI YGGC EGN AN 45 136 AAT TTT ATCACC AM GAG GM TGC GM AGC ACC TGT GCT GCC TGA 180 46 NFI TKE ECE STCAA* 60 。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供ー种具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-Ι，它能够通过以分泌表达的方式大量生产获得，并具有较高的抑制plasmin的生物活性。该重组textilinin-Ι可以作为止血药，用于手术过程中纤维蛋白被纤溶酶溶解导致的失血过多。本专利技术提供了ー种具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-Ι，其氨基酸序列为 KDRPDFCELP ADTGPCRVRF PSFYYNPDEK KCLEFIYGGC EGNANNFITK EECESTCAA 其特征在于，所述具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-Ι，是通过将人工合成的textilinin-1结构基因在酵母菌中，或者在CHO细胞或其它哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式大量产生获得，其中人工合成textilinin-Ι结构基因序列为 IAAG GAT AGA CCA GAT TTT TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA 45 46 TGT AGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAG 90 91 AAG TGT TTG GAA TTT ATT TAC GGT GGT TGT GAA GGT AAC GCT AAC 135 136 AAC TTT ATT ACT AAG GAA GAA TGT GAA TCT ACT TGT GCT GCT TAA 180。本专利技术还提供了所述重组textilinin-Ι的制备方法，其特征在于，制备方法为将人工合成的textilinin-Ι结构基因在酵母菌中，或者在CHO细胞或其它哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式大量产生重组textilinin-Ι,其中人工合成textilinin-Ι结构基因序列最好为 IAAG GAT AGA CCA GAT TTT TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA 45 IKDR P DF CEL PA DTGP 15 46 TGTAGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAG 90 16 CRVRF PS FYY NP D E K 30 91 AAG TGT TTG GAATTT ATT TAC GGT GGT TGT GM GGT AAC GCT AAC 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin？1，其氨基酸序列为：？KDRPDFCELP？？ADTGPCRVRF？？PSFYYNPDEK？？KCLEFIYGGC？？EGNANNFITK？？EECESTCAA，其特征在于，所述具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin？1，是通过将人工合成的textilinin？1结构基因在酵母菌中，或者在CHO细胞或其它哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式大量产生获得，其中人工合成textilinin？1结构基因序列为：？1？？？？AAG？GAT？AGA？CCA？GAT？TTT？TGT？GAA？TTG？CCA？GCT？GAT？ACT？GGT？CCA？？？4546？？？TGT？AGA？GTT？AGA？TTT？CCA？TCT？TTT？TAC？TAC？AAC？CCA？GAT？GAA？AAG？？？9091？？？AAG？TGT？TTG？GAA？TTT？ATT？TAC？GGT？GGT？TGT？GAA？GGT？AAC？GCT？AAC？？135136？？AAC？TTT？ATT？ACT？AAG？GAA？GAA？TGT？GAA？TCT？ACT？TGT？GCT？GCT？TAA？？180。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：薛百忠，徐梅，杨宇，张宏杰，李娜，刘剑，邸伟庆，刘宏大，王宏英，薛雁，
申请(专利权)人：辽宁诺康生物制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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