本发明专利技术涉及一种手性分离多种侧链保护氨基酸的方法，以解决高效液相色谱法手性分离体系中使用的流动相体系比较繁琐和手性色谱柱不稳定的技术问题。技术方案：一种手性分离多种侧链保护氨基酸的方法，其特征是：包括以下步骤：a、4种外消旋体溶解在甲醇和水溶液中，超声处理后过滤，取滤液待用；b、手性色谱柱平衡好后分别吸取滤液进入高效液相色谱系统，通过色谱工作站采集手性分离色谱图，通过查看分离参数获取氨基酸分离效果。本发明专利技术所述的方法，使用的流动相是在高效液相色谱中很常用的试剂，除了高效液相色谱仪不再需要别的仪器，既节省成本又能够简单、快速地手性分离多种侧链保护的氨基酸。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用大环抗生素-替考拉宁键合的手性固定相来手性分离侧链带保护的氨基酸，利用手性固定相在高效液相色谱系统上手性分离一些侧链带保护的氨基酸对映异构体，DL-天门冬氨酸-4-叔丁基酯,DL-谷氨酸-5-叔丁基酯,O-叔丁基-DL-丝氨酸，O-叔丁基-DL-酪氨酸。
技术介绍
由于药物治疗多肽副作用低，药效高，针对性强，不会蓄积于体内而引起中毒的优点，越来越多的多肽药物应用到了癌症，肝炎，糖尿病临床治疗中，目前国内的药物治疗多肽发展迅速，目前药物多肽合成方法中无论是液相合成，固相合成，片段连接都会使用到氨基酸衍生物作为原料，而氨基酸衍生物的光学纯度对合成多肽的质量尤为重要，因此需要 一种快速，简单，经济，应用范围广的手性分离方法。目前报道的氨基酸手性分离的方法集中在非衍生化的天然氨基酸和主链N端有Boc，Z,或者Fmoc保护的这些方面，主要是利用冠醚，纤维素，大环抗生素类手性固定相来进行手性分离(高效液相色谱手性冠醚固定相拆分丙氨酸，正缬氨酸和犬尿氨酸对映体2009 ;在替考拉宁键合的手性固定相上比较N-叔丁氧羰基氨基酸及其未保护氨基酸类似物的对映体选择性分离1999 Comparison of enantioselective separationof N-tert-butyIoxycarbonyl amino acids and their non—blocked analoguesteicoplanin-based chiral stationary phase 1999)),侧链的羧基或者轻基带保护基团而主链上未保护的氨基酸手性分离的报道却很少。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用高效液相色谱法，同时使用键合替考拉宁的手性固定相进行多种侧链保护氨基酸衍生物的手性分离方法，考察流动相中有机相的比例对手性分离的影响，最终确定合适的分离条件。主要解决解决高效液相色谱法手性分离体系中使用的流动相体系比较繁琐和手性色谱柱不稳定的技术问题。本专利技术的技术方案如下，采用替考拉宁手性固定相的高效液相色谱方法。包括以下步骤 I、用色谱级的甲醇和蒸馏水超声脱气，作为流动相。2、甲醇和水作为流动相，以甲醇比水体积比40:60的比例平衡手性色谱柱，平衡30分钟，待紫外检测器的基线维持在零点左右时可以准备分析样品。手性色谱柱ChiroBioticT (替考拉宁键合填料)，5 μ m, 4. 6 X 250mm (I. D) 流动相 A:水；B:甲醇时间(min)AB O.0160%40%50.O60%40%流速0. 4ml/min ;波长:220nm。3、将DL-天门冬氨酸-4-叔丁基酯、DL-谷氨酸_5_叔丁基酯、O-叔丁基-DL-丝氨酸、O-叔丁基-DL-酪氨酸等外消旋样品配制成一定浓度，用甲醇-水混合溶液溶解，过滤作为待进样品。4、将配制好的样品注射进入高效液相色谱系统，在手性固定相分离后，通过色谱工作站记录分离色谱图，并查看相关的分离参数，手性分离度这个关键指标要好，一般分离度要大于I. 5。按照本专利技术，所述的手性分离多种侧链保护氨基酸的方法，手性色谱柱使用的是以硅胶为基质的，在硅胶基质上化学键合大环抗生素-替考拉宁的手性色谱柱(Tei-CSP)。本专利技术所用的样品溶解条件为体积比甲醇水=40:60 ； 本专利技术所述的样品在4. 6mm内径的分析柱上的样品浓度分别为 DL-谷氨酸-5-叔丁基酯10mg/ml ；0-叔丁基-DL -丝氨酸10mg/ml ； DL-天门冬氨酸-4-叔丁基酯10mg/ml ；0-叔丁基-DL-酪氨酸O. 6mg/ml。本专利技术的有益效果 解决了侧链羧基被叔丁酯化或者侧链羟基被叔丁基化这类氨基酸的手性分离问题，本专利技术所述的手性分离方法，使用的流动相比较简单，分离速度快，并且分离的条件对于温度也没有特殊要求，分离过程中不需要柱温箱，不增加仪器成本，同时替考拉宁键合的手性柱稳定性比较好，在手性分离上千次样品后仍能得到很好的手性分离效果，同时这种手性柱也能用于其它类的氨基酸，肽，和手性药物的手性分离，使用范围广，有很好的经济价值。附图说明图I为DL-谷氨酸-5-叔丁基酯消旋体在替考拉宁键合手性固相上，流动相为甲醇水体积比=20:80的分离图。图2为DL-谷氨酸-5-叔丁基酯消旋体在替考拉宁键合手性固相上，流动相为甲醇水体积比=30:70的分离图。图3为DL-谷氨酸-5-叔丁基酯消旋体在替考拉宁键合手性固相上，流动相为甲醇水体积比=40:60的分离图。图4为O-叔丁基-DL-丝氨酸消旋体在替考拉宁键合手性固相上，流动相为甲醇水体积比=20:80的分离图。图5为O-叔丁基-DL-丝氨酸消旋体在替考拉宁键合手性固相上，流动相为甲醇水体积比=30:70的分离图。图6为O-叔丁基-DL-丝氨酸消旋体在替考拉宁键合手性固相上，流动相为甲醇水体积比=40:60的分离图。图7为DL-天门冬氨酸-4-叔丁基酯在替考拉宁键合手性固相上，流动相为甲醇水体积比=20:80的分离图。图8为DL-天门冬氨酸-4-叔丁基酯在替考拉宁键合手性固相上，流动相为甲醇水体积比=30:70的分离图。 图9为DL-天门冬氨酸-4-叔丁基酯在替考拉宁键合手性固相上，流动相为甲醇水体积比=40:60的分离图。图10为O-叔丁基-DL-酪氨酸在替考拉宁键合手性固相上，流动相为甲醇水体积比=20:80的分离图。图11为O-叔丁基-DL-酪氨酸在替考拉宁键合手性固相上，流动相为甲醇水体积比=30:70的分离图。图12为O-叔丁基-DL-酪氨酸在替考拉宁键合手性固相上，流动相为甲醇水体积比=40:60的分离图。具体实施例方式4种外消旋体溶解，过滤 I)分别称取3mg的O-叔丁基-L-酪氨酸和3mg的O-叔丁基-D-酪氨酸溶于IOml 的容量瓶中(即配制O. 6mg/ml浓度的O-叔丁基-DL-酪氨酸)，用甲醇与水溶液体积比例40:60溶液溶解，超声处理，待样品完全澄清，加溶液至刻度线，用0.45 μ m有机相滤头过滤，取滤液待用。2)其它3种氨基酸衍生物溶解，分别称取5mg的L型和5mg的D型样品置于Iml的样品管中(即配制浓度为10mg/ml的DL-谷氨酸-5-叔丁基酯，O-叔丁基-DL -丝氨酸，DL-天门冬氨酸-4-叔丁基酯)，用甲醇与水溶液体积比例40:60溶液溶解，超声处理，待样品完全澄清,用O. 45 μ m有机相滤头过滤，取滤液待用。色谱条件沃特斯515高压输液泵，沃特斯2489紫外检测器，HS-2000色谱工作站。流动相A :色谱级甲醇，B:蒸馏水,0.01分钟到50分钟A: B体积比=40:60 ;流速O. 4ml/min ;波长220nm ;手性色谱柱ChiroBiotic T, 5 μ m, 4. 6 X 250mm (I. D)，进样量5μ1。分尚图见图I 图12。色谱条件的选择 I. I手性色谱柱的选择 替考拉宁是从垣霉素游动放线菌(Actinoplanes teichomyceticus)菌发酵液中得到的一种新型的糖肽类大环抗生素，作为手性固定相具有广泛的手性识别能力，可拆分的化合物包括未衍生的氨基酸，衍生氨基酸，肽，酸性化合物，含有芳香基团的环状化合物，碱性药物等，同时替考本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种手性分离多种侧链保护氨基酸的方法，其特征是：包括以下步骤：a、将4种外消旋体溶解在甲醇和水溶液中，超声处理后过滤，取滤液待用；b、手性色谱柱平衡好后分别吸取滤液进入高效液相色谱系统，通过色谱工作站采集手性分离色谱图，通过查看分离参数获取氨基酸分离效果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：巢庆，徐红岩，
申请(专利权)人：吉尔生化上海有限公司，上海吉尔多肽有限公司，无锡亚肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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