原核来源的泛素样分子的应用制造技术

原核来源的泛素样分子的应用，技术领域：生物工程。本发明专利技术公开了一种提高重组目的蛋白表达水平的有效方法。通过将原核来源的泛素样分子，特别是硫转运分子MoaD或ThiS与目的蛋白的重组融合表达，可获得较高水平的目的蛋白产物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，特别涉及重组蛋白的异源表达。
技术介绍
通过异源基因在宿主细胞，包括细菌、酵母菌、哺乳动物细胞以及昆虫细胞等中进行表达，是目前生产蛋白和/或多肽产品最为常用的方法。使用异源表达系统获得具有生物学活性的均一蛋白，在功能基因组学的研究中也广泛应用。大肠杆菌等原核系统由于菌体细胞简单，表达蛋白成本低廉，得到了更广泛的应用。然而，不同的异源基因，在同样的宿主细胞，尽管使用相同的表达载体，获得同样的转录和翻译信号，但重组蛋白表达水平可以有很大差别。某些重组蛋白在宿主细胞中不能高效表达有很多原因，包括宿主细胞的密码子偏好引起异源基因转录和翻译水平低下；重组蛋白由于自身不稳定性，易于被宿主蛋白酶切降解；错误折叠的重组蛋白对宿主细胞 酶切降解的易感性提高等等。为提高重组蛋白的表达水平，可以采取一些策略。例如，在蛋白酶缺失的大肠杆菌菌株中进行表达，以增加重组蛋白的稳定性(Gottesman et al. J Bacteriol 1978. 133 844-51);将宿主蛋白片段与目标重组多肽/蛋白融合，也可以增加外源蛋白在宿主细胞中的稳定性(Itakura et al.，Science, 1977. 198 1056-63 ；Shen, Proc Natl Acad SciUSA, 1984. 81 :4627-31);在原核宿主细胞，将分泌前导序列融合至重组蛋白，可以促使基因产物在细胞周质的累积或外排分泌，提高正确折叠的可溶性蛋白的复性，可能提高蛋白产量(Nilsson et al. ,EMBO J, 1985. 4 :1075-80 ；Abrahmsen et al. ,Nucleic Acids Res,1986. 14 :7487-500)。这些策略对某些蛋白来说有效，但对许多其它蛋白却不一定成功。因此，存在多种基因融合系统，使用不同的融合伴侣与异源蛋白连接。常见的原核来源的融合伴侣包括谷胱甘肽硫转移酶GST(Smith，Methods Enzymol, 2000. 326 :254-70)，硫氧还原蛋白 TRX (Hammarstrom et al.，Protein Science, 2002. 11 :313-321),以及麦芽糖结合蛋白 MBP (Sachdev et al. , Methods Enzymol, 2000. 326 :312-21)等。真核来源的泛素Ubquitin和小泛素样分子Sumo也是常见的融合伴侣。泛素是一种在所有真核细胞中广泛存在，序列结构高度保守的低分子量蛋白质，能够与靶蛋白形成共价结合，是蛋白翻译后修饰的一个重要方式。同时，真核细胞中还存在一些与泛素结构类似的蛋白质，称为泛素样蛋白(UBLs) (Dye et al. Annu Rev BiophysBiomol Struct. 2007 ;36 :131-50.)。该家族成员具有两个共同的结构特征，P -手握样折叠(0-grasp fold)结构域,和含有双甘氨酸残基的羧基末端柔性结构。他们对祀蛋白的化学修饰方式与泛素相同，既羧基末端的甘氨酸残基与靶蛋白赖氨酸残基侧链氨基形成异肽键连接，但可以产生与泛素化修饰不同的生物效应。已知的UBLs包括SUM01/2/3，ISG15，FAT10, ATG8/12, NEDD8, UFMl, URMl 等。泛素化一个最主要的作用就是将革巴蛋白传递给26S蛋白酶体进行降解(Welchmanet al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005 ;6 :599-609)。另一方面，靶蛋白被 Sumo 化后并不会引起蛋白的降解，而是直接或问接改变蛋白在细胞内的定位。尽管他们在真核细胞对靶蛋白的作用不同，但在原核细胞作为融合伴侣表达系统，他们都可以提高目的重组蛋白的稳定性。(Baker et al. J Biol Chem. 1994 ;269 :25381-6, Butt et al. Protein ExprPurif. 2005 ；43 :1_9.)泛素及Sumo与不表达或低表达蛋白的N-末端进行融合，可以显著提高在真核细胞以及原核细胞内的表达水平。美国专利7820384也把其它真核来源的泛素样分子包括RUB、HUB、APG8、APG12、URMl和ISG15作为融合伴侣，作为提高宿主细胞中目的蛋白表达水平的方法。尽管通常认为原核细胞不存在泛素化修饰系统，但从蛋白高级结构、生化反应等分析发现，原核细胞中广泛存在的硫转运系统，与真核泛素化修饰系统有进化意义上的关联(Rudolph et al. Nat Struct Biol. 2001；8 42-6,Wang et al. Nat Struct Biol. 2001 ；8 :47-51, Xu et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 ;103 :11625-30.)。细菌在钥蝶呤molybdopterin和硫胺素thiamine的合成途径中，需要硫原子的掺入,硫原子分别由硫转运分子MoaD和ThiS提供。硫转运分子ThiS和MoaD也含有P手握样折叠结构域及羧基 末端双甘氨酸残基，与泛素，特别是URMl有一定的序列同源性。2008 年，Science 杂志首次报道(Pearce et al. Science. 2008 ；322 :1104-7. ) 了结核菌属发现类泛素化修饰分子Pup，该小蛋白分子与靶蛋白赖氨酸残基侧链氨基形成异肽键连接。Pup修饰可诱导靶蛋白分子被蛋白酶体降解。2010 年，在 Nature 杂志又报道(Humbard et al. Nature. 2010 ；463 54~60) 了古细菌类泛素化修饰分子SAMP1/2。通常认为古细菌是独立于真核系统和原核系统的第三类生命形式。SAMPl and SAMP2含有3手握样折叠结构域及羧基末端双甘氨酸残基，其末端甘氨酸残基可与靶蛋白赖氨酸残基侧链氨基形成异肽键连接，并影响靶蛋白的稳定性。值得注意的是，SAMP1/2在古细菌中分别属于MoaD和ThiS的类似物。然而，目前尚不知道原核细胞中具有泛素样结构的硫转运分子MoaD和ThiS，是否具有泛素化修饰功能，以及他们作为原核来源的泛素样分子，成为融合伴侣表达系统的可行性。
技术实现思路
本专利技术涉及原核来源的泛素样分子。这些分子完全或部分具有泛素样结构。他们可以具有泛素样修饰功能。本专利技术发现，原核细胞广泛存在保守的类泛素化修饰系统。硫转运分子ThiS和MoaD是原始的功能性类泛素分子，他们可对菌体蛋白产生共价修饰(图I)。他们对靶蛋白的化学修饰方式不同=ThiS的靶蛋白共价结合物对还原剂敏感，DTT处理可使其失去大部分共价连接，而MoaD的靶蛋白共价结合物对还原剂不敏感(图2)。本专利技术发现，具有泛素样结构域的原核硫转运分子MoaD，可作为融合伴侣，显著提高宿主菌中重组蛋白的稳定性和/或表达水平。本专利技术也发现，具有泛素样结构域的原核硫转运分子ThiS，尽管会促进不稳定蛋白在细菌体内的降解，但可作为融合伴侣，显著提高宿主菌中某些重组蛋白的表达水平。本专利技术提供了一个用于表达融合多肽的方法，该融合多肽含有原核硫转运分子MoaD或其结构上的类似物、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个在宿主细胞中提高重组目的蛋白表达水平的方法，包括1)将编码一种原核来源的泛素样分子，或其结构上的类似物或衍生物、或其部分片段的核苷酸序列，连接到所述目的蛋白的核苷酸序列上，由此构建出编码一个融合蛋白的核酸序列；2)将该核酸序列连接在合适的表达载体内；3)将含所述核酸序列的表达载体转入所述的宿主细胞，通过所述的融合蛋白中出现所述的原核来源的泛素样分子，或其结构上的类似物或衍生物、或其部分片段，来提高所述的目的蛋白在所述宿主细胞中的表达水平。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王楠，许建，葛莹，
申请(专利权)人：威志兰斯医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：