转番茄TFT6和TFT7基因在提高植物耐土壤低磷环境中的应用制造技术

转番茄TFT6和TFT7基因在提高植物耐土壤低磷环境中的应用，获取TFT6和TFT7的DNA序列，以PCR手段从番茄体内克隆了TFT6和TFT7基因的编码区，经测序鉴定后连接至改造过的载体pBI121，再以蘸花法转化植物。在低磷胁迫的条件下，和野生型拟南芥、转TFT6基因拟南芥和转TFT7基因拟南芥相比，转基因嫁接植物（地上部过量表达TFT6和根中过量表达TFT7）都具有较高的磷含量和干物质重，表明转番茄TFT6和TFT7基因的嫁接植物具有较大程度地提高植物耐低磷胁迫的能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程领域，具体地说是通过转基因手段与精微嫁接技术将番茄TFT6和TFI7基因分别表达于植物的地上部和根中，从而进一步提高转基因嫁接植物耐土壤低磷环境的能力及其应用。
技术介绍
土壤低磷是我国粮食减产的重要原因之一。改良土壤低磷的途径与方法很多，一些研究表明提高植物耐土壤低磷的遗传潜力也是有效的方法之一。近年来，研究显示植物14-3-3蛋白在调控植物抵御低磷胁迫过程中可能扮演主要角色。人们利用转基因植物为材料在植物耐低磷方面做了一些工作，但关于14-3-3蛋白在方面的作用研究较少。尽管14-3-3蛋白在调控植物抵御低磷胁迫过程中可能扮演主要角色，但这方面的直接证据较少。番茄是适应性很强的作物，从北极圈到赤道都有栽培。尽管番茄对各种气候条件适应性很强，但不良环境因子的胁迫对产量的影响仍然很大，低磷胁迫是这些不良环境之一且严重影响番茄的产量和品质。因此，提高番茄的耐低磷能力具有重要意义。番茄体内14-3-3蛋白基因家族共有12个成员，TFT6是其中的第六号成员，而TFI7是其中的第七号成员。
技术实现思路
解决的技术问题本专利技术针对土壤低磷的现状，通过转基因手段与精微嫁接技术将番茄TFT6和TFI7基因分别表达于植物的地上部和根中，从而进一步提高转基因嫁接植物耐土壤低磷环境中的能力。技术方案转番茄TFT6和TFI7基因在提高植物耐土壤低磷环境中的应用，所述植物为拟南芥。转番茄TFT6和TFI7基因在提高植物耐土壤低磷环境中的应用，步骤为a.构建转基因拟南芥提取番茄RNA和逆转录为cDNA，通过SEQ ID No. I所示的TFT6和SEQID No. 2所示的TFI7的DNA序列，以PCR手段从番茄体内克隆了 TFT6和TFI7的编码区，其中 TFT6 的引物为 TTACGAGGAGATGGTAGAGTTC ；AGAGCCAATGAGCTTAGAATC, TFT7 的引物为ACCTCGITCCTTCGTCCACTAC ；AATTCAATGCGAGTCCAAGTC ;经测序鉴定后连接至质粒载体PBI121 ;再以蘸花法转化拟南芥，得到分别含有TFT6和TFI7基因的转基因拟南芥；b.拟嫁接的转TFT6或TFI7的拟南芥种子灭菌春化后，生长在垂直无菌琼脂板；琼脂板放在温度21°C，持续光照的培养室并保持垂直培养3天，然后再放在温度23°C，8小时光照和16小时黑暗下垂直培养3天；在无菌操作环境下，将植物的地上部与根分开，培养板在完全水平的角度下切割，然后在完全垂直的角度嫁接，将地上部与根系连接，后用硅管套住，嫁接过的植株用琼脂板培养6天，直至嫁接的结合点痊愈，然后植株移入l/5Hoagland的水培体系，再生长3天，得到转基因拟南芥植株。转番茄TFT6和TFI7基因的嫁接植物在提高植物耐土壤低磷环境中的应用，获取TFT6和TFI7的DNA序列(见表2)，以PCR手段从番茄体内克隆了 TFT6和TFI7基因的编码区，经测序鉴定后连接至改造过的载体PBI121，再以蘸花法转化植物并进一步鉴定(见图I)，然后利用精微嫁接技术将转TFT6拟南芥植物的地上部与转TFI7植物的根系进行嫁接并鉴定(见表3)，使TFT6和TFI7分别特异地表达于植物的地上部和根中。有益效果在低磷胁迫的条件下，和野生型拟南芥、转TFT6基因拟南芥和转TFI7基因拟南芥相比，转基因嫁接植物(地上部过量表达TFT6和根中过量表达TFT7)都具有较高的磷含量和干物质重，表明转番茄TFT6和TFI7基因的嫁接植物具有较大程度地提高植物耐低磷胁迫的能力(见图2和图3)。附图说明图I为转TFT6和TFI7植物的鉴定。L6-1至L6-6为转TFT6基因拟南芥的6个不同株系；L7-1至L7-6为转TFI7基因拟南芥的I个不同株系；图2为低磷胁迫下，和野生型拟南芥、转TFT6基因拟南芥和转TFI7基因拟南芥相t匕，转TFT6和TFI7嫁接植物体内的干重和磷含量；图3为低磷胁迫下，和野生型拟南芥、转TFT6基因拟南芥和转TFI7基因拟南芥相t匕，转TFT6和TFI7嫁接植物的韧皮部蔗糖转运和根系分泌质子的速率。具体实施例方式申请人:首先构建了分别过量表达TFT6和TFI7的转基因拟南芥植物，研究显示和野生型拟南芥植物相比(Columbia)，转TFT6和TFI7拟南芥植物提高了对低磷的耐性，不同之处在于，TFT6主要在地上部起作用(调控地上部蔗糖向根中转运)，而TFI7主要在根中起作用(调控根系分泌质子)。再之，申请人利用精微嫁接技术将转TFT6拟南芥植物的地上部与转TFI7植物的根系进行嫁接，使TFT6和TFI7分别特异地表达于植物的地上部和根中，不但增加了转基因嫁接植物地上部蔗糖的转运，还提高了转基因嫁接植物的根际酸化能力，从地上部与根系之间“上下协调”的角度，大大地提高了植物的耐低磷能力。因此，申请人通过转基因方法和精微嫁接技术研究了植物耐低磷过程中TFT6和TFI7的角色和相互之间的功能协调效应，能为通过分子生物学手段提高植物耐低磷的能力和改良土壤低磷环境提供能应用的基因和手段，也为通过分子育种手段提高番茄耐低磷胁迫的能力打下进一步的研究基础。实施例I :材料与方法植物材料、生长状态、低磷胁迫处理我们培养番茄的手段为水培，营养液是稀释倍数为1/5的Hoagland溶液。我们利用MS培养基板(l%wt琼脂和l%wt蔗糖)培养拟南芥。处理手段为正常生长(CK :磷浓度为ImM)和低磷胁迫(LP:磷浓度为I y M)。对于生长试验，我们取正常萌发5天后的生长一致的拟南芥为材料，将其移到正常MS培养基板和处理的MS培养基板生长10天后，取拟南芥植株(苗龄15天)于液氮固定后，储存于_80°C冰箱以待分析用。每次试验重复三次，每次取10颗拟南芥植株。另外，每次试验至少重复两次(生物重复)。构建转基因拟南芥提取番茄RNA和逆转录为cDNA。我们从GENEBANK的网站上得到TFT6和TFI7的DNA序列，以PCR手段从番茄体内克隆了 TFT6和TFI7的编码区，经测序鉴定后连接至载体PBI121。所有分子操作的方法见《分子克隆实验指南》第二版。我们以蘸花法(Floral dip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana. The plant journal 1998，16，735-743.)转化拟南芥。经过一系列的筛选、培养、鉴定之后，我们最后以转基因T3代的纯合系为材料进行试验分析。实验中所用的引物见表I。表I实验中使用的PCR引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
转番茄TFT6和TFT7基因在提高植物耐土壤低磷环境中的应用。

【技术特征摘要】
1.转番茄TFT6和TFT7基因在提高植物耐土壤低磷环境中的应用。2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述植物为拟南芥。3.转番茄TFT6和TFT7基因在提高植物耐土壤低磷环境中的应用，其特征在于步骤为 > a.构建转基因拟南芥提取番茄RNA和逆转录为cDNA，通过SEQID No. I所示的TFT6和SEQ ID No. 2所示的TFT7的DNA序列，以PCR手段从番茄体内克隆了 TFT6和TFT7的编码区，其中 TFT6 的引物为 TTACGAGGAGATGGTAGAGTTC ；AGAGCCAATGAGCTTAGAATC, TFT7 的引物为ACCTCGTTCCTTCGTCCACTAC ；AATT...

【专利技术属性】
技术研发人员：许卫锋，施卫明，张建华，黄梦静，周峰，
申请(专利权)人：中国科学院南京土壤研究所，
类型：发明
国别省市：