富血小板血浆的提取方法和提取的富血小板血浆技术

本发明专利技术涉及富血小板血浆的提取方法和提取的富血小板血浆。具体地，本发明专利技术涉及从血液中提取富血小板血浆的方法，其包括以下步骤：(a)使采集的全血置于含有抗凝剂的容器中，使血液和抗凝剂充分混匀；(b)使混有抗凝剂的血液置于离心管中，进行第一次离心，使血液基本上分成三层；(c)将最上层和大部分的中间层抽出并转移到新的离心管中，混合均匀，进行第二次离心；(d)弃掉离心管上层的血浆，利用剩余的血浆使沉淀的血小板重新悬浮，即得富血小板血浆(Platelet?Rich?Plasma：PRP)。本发明专利技术方法操作过程简单、收率高、富集的血浆中血小板浓度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属临床医学
，具体涉及一种提取富含血小板的血浆的方法，本专利技术方法在特定条件下获得的富血小板血浆具有血小板浓度高、血小板回收率高等至少一个方面的优点。
技术介绍
富含血小板的血浆，在本专利技术中可称为富血小板血浆(Platelet Rich Plasma,PRP)，其是是通过离心血液而得到的含高浓度的血小板血浆。人体的血小板除了可以在止血的时候提供凝聚作用外，血小板中还含有很多与创伤愈合和骨头再生有关的多种生长因子。如血小板衍生生长因子(Platelet Derived Growth Factor, F1DGF),转化生长因子(Transforming Growth Factor,TGF),膜岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor, IGF),表皮生长因子(Epidermal Growth Factor, EGF)以及血管内皮生长因子(VascularEndothelial Growth Factor,VEGF)等等,血小板来源的生长因子,对细胞的分化和增殖起着促进作用，这些生长因子相互之间具有协同响应，与其他促进细胞活性的因子相互作用和影响，共同维持着组织环境的平衡，对伤口愈合、修复和再生有着重要的作用。另外，由于PRP可以从患者自身血液中提取，经提取富集处理后，可用于相关疾病的治疗，因而来源丰富，取材方便，制备方法简单而且可以让身体吸收。自身PRP使用能避免病毒传播和免疫排斥的问题出现。因此PRP被广泛应用到不同的医学领域中。如骨科、口腔科、颌面外科、运动医学以及美容医学。PRP在目前为止还没有一个统一的制备方法，PRP的制备原理主要是利用血液中各种成分沉降速度不同，通过离心将血液分层。从而获取含血小板的血浆，并利用离心原理进一步的浓缩以获得高浓度的血小板血浆。人体全血中血小板的浓度一般为1 3X 105/ml。研究认为浓缩后的PRP血小板浓度应为全血血小板浓度的3-4倍。研究也发现PRP中血小板浓度的提高能有效提高干细胞的增殖和分化能力以及能够显著增加成纤维细胞的增殖和I型胶原蛋白的表达。因此有效的分离和提高PRP中血小板的浓度成为了整个PRP治疗方案的关键。林庶茹等(CN101402940A，中国专利申请号200810228726. 5，专利技术名称一种小鼠血小板的提取方法)公开了一种小鼠血小板的提取方法，小鼠眶静脉取血，置于抗凝离心管中，静置30MIN后离心，800RPM离心10MIN，上清液即为富含血小板的血浆。吸出上清液置于干净试管中，3500RPM离心10MIN，弃去上清液，管底沉淀物为血小板。向试管中滴加50 100ML质量浓度为1%草酸铵溶液，以玻璃棒轻轻搅拌，再加入质量浓度为1%草酸铵溶液2 3ML，静置5MIN，使红细胞溶解。3500RPM离心10MIN，弃去上清，加入血小板洗涤液并反复吹打，使成为血小板混悬液，3300RPM离心10MIN，弃去上清，加入少量血小板洗涤液并反复吹打使之成为混悬液。该血小板将作为抗原免疫豚鼠后，取豚鼠血清给小鼠注射，制备过敏性紫癜模型。此方法操作简单，可以得到高浓度的血小板，并很好地解决血小板纯度不佳的问题。这种针对小鼠血液进行血小板富集的方法虽然据信可以获得浓度达101°的血小板，然而该方法未公开其血小板的收率，并且方法在操作上比较繁杂，难以适用于人血的处理。此外，王悦等(CN102078644A，中国专利申请号201110053979. 5，专利技术名称一种简便高效的自体富血小板血浆提取装置及提取方法)中公开了一种简便高效的自体富血小板血浆提取装置及提取方法，所提取的自体富血小板血浆中含有多种复合生长因子，能够有效地促进组织的修复。由I个注射器、I个静脉输液器连接管、I个静脉留置针塑料卡片和I个静脉输液器针头组成；注射器用以抽取静脉血并充当离心管；静脉输液器针头通过静脉输液器连接管和注射器出口连接，静脉输液器针头用以皮肤血管穿刺、抽取抗凝剂和激活剂并向人体需要部位注射提取后的自体富血小板血浆；静脉输液器连接管可弯曲固定于静脉留置针塑料卡片中。据信这种装置在提升血小板提取的操作性方面是有益的。因此为了从血液中富集血小板而得到有临床治疗意义的富血小板血浆，探寻一种操作过程简单、收率高、富集的血浆中血小板浓度高的方法，是本领域技术人员迫切期待的。
技术实现思路
本专利技术的目的是探索一种简单和高效地分离和浓缩血浆中血小板的方法；特别是本专利技术为了从血液中富集血小板而得到有临床治疗意义的富血小板血浆，探寻一种操作过程简单、收率高、富集的血浆中血小板浓度高的方法。本专利技术人发现利用梯度离心法进行血小板的浓缩和分离，在特定操作条件下可以以高收率地获得含浓度高血小板的血浆。为此，本专利技术第一方面提供了一种从血液中提取富血小板血浆的方法，其包括以下步骤(a)使采集的全血置于含有抗凝剂的容器中，使血液和抗凝剂充分混匀；(b)使混有抗凝剂的血液置于离心管中，进行第一次离心，使血液基本上分成三层；(C)将最上层和大部分的中间层抽出并转移到新的离心管中，混合均匀，进行第二次离心；(d)弃掉离心管上层的血浆，利用剩余的血浆使沉淀的血小板重新悬浮，即得富血小板血衆(Platelet Rich Plasma PRP)。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(a)中所述全血是新鲜的全血。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(a)中所述全血是受试个体例如患者的全血。由此，本专利技术获得的富血小板血浆可以方便地重新用于该患者以治疗相关疾病。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(a)中抗凝剂选自乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid :EDTA)、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸I丐钠、枸橡酸葡萄糖(Acid Citrate Dextrose-Solution A :ACD_A)、或其组合。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(a)中抗凝剂与全血的重量比为I :8 10，例如I :9。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(a)中所述容器可以是离心管或是采血袋等。如果是离心管并且该离心管容量适合直接离心，则所述步骤(b)中不需要另置于离心管中，而可以直接进行离心。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(a)中还包括在使血液和抗凝剂后取适量(例如少于500ul，例如约IOOul)用于测定其中血液中血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(b)中经第一次离心后是达到使血液基本上分成三层的程度。在一个实施方案中，其中最上层是含血小板的血浆层，中间一层是血块黄层(Buffy Coat层，其中含有血小板和白细胞)，最底层的是红细胞层。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(b)中离心的转速为2000rpnT3000rpm，例如 2200rpm 2800rpm,例如 2300rpm 2500rpm,例如约 2400rpm。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(b)中离心的时间为1-lOmin，例如2_8min,例如 3_5min,例如约 4min。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(b)中离心的转速为2300rpnT2500rpm，时间为 3_5min。·根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(b)中离心的转速为2本文档来自技高网...

【技术保护点】
从血液中提取富血小板血浆的方法，其包括以下步骤：(a)使采集的全血置于含有抗凝剂的容器中，使血液和抗凝剂充分混匀；(b)使混有抗凝剂的血液置于离心管中，进行第一次离心，使血液基本上分成三层；(c)将最上层和大部分的中间层抽出并转移到新的离心管中，混合均匀，进行第二次离心；(d)弃掉离心管上层的血浆，利用剩余的血浆使沉淀的血小板重新悬浮，即得富血小板血浆(Platelet？Rich？Plasma：PRP)。

【技术特征摘要】
1.从血液中提取富血小板血浆的方法，其包括以下步骤 (a)使采集的全血置于含有抗凝剂的容器中，使血液和抗凝剂充分混匀； (b)使混有抗凝剂的血液置于离心管中，进行第一次离心，使血液基本上分成三层； (C)将最上层和大部分的中间层抽出并转移到新的离心管中，混合均匀，进行第二次离心； (d)弃掉离心管上层的血浆，利用剩余的血浆使沉淀的血小板重新悬浮，即得富血小板血衆(Platelet Rich Plasma PRP)。2.根据权利要求I的方法，其中步骤(a)中 所述全血是新鲜的全血；和/或 所述全血是受试个体例如患者的全血。3.根据权利要求I至2任一项的方法，其中步骤(b)中 所述抗凝剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸钙钠、枸橼酸葡萄糖、或其组合； 所述抗凝剂与全血的重量比为I :8 10 ;和/或 所述步骤(a)中还包括在使血液和抗凝剂后取适量用于测定其中血液中血小板的数量的步骤。4.根据权利要求I至3任一项的方法，其中步骤(b)中 经第一次离心后是达到使血液基本上分成三层的程度；和/或 经第一次离心后是达到使血液基本上分成三层的程度，其中最上层是含血小板的血浆层，中间一层是血块黄层，最底层的是红细胞层。5.根据权利要求I至4任一项的方法，其中步骤(b)中 离心的转速为2000rpnT3000rpm ； 离心的时间为I-IOmin ...

【专利技术属性】
技术研发人员：林卓衡，陈俊峯，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：