组合物及甲硫氨酸的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种以内源基因的转硫途径，同时以外源基因的定向巯基化途径生产甲硫氨酸和相关产物的微生物；还公开了这些新型基因可用于甲硫氨酸和SAMe的生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了组合物，以及用如微生物、酶和化学物质生产甲硫氨酸及相关产物的方法。
技术介绍
甲硫氨酸是动物食谱中的必需氨基酸。长期以来，甲硫氨酸的制备是采用丙烯醛、甲硫醇和氰化物作为起始物质，通过各种多步化学反应合成的。有两种产物形式D，L甲硫氨酸及其羟基类似物。与其它氨基酸不同，D-甲硫氨酸在体内转化为必需的L-异构体。据报导，由于家禽需求量的增加和近来作为猪饲料添加剂，饲料级甲硫氨酸的市场在不断扩大。甲硫氨酸的主要生产商(Degussa AG, Adisseo和Novus)满足市场需求的能力取决于原料供应。中间产物丙烯醛和甲硫醇必须转化为3-甲基硫丙醛 (3-methylthiopropionaldehyde,MMP)并通过氢氰酸进一步转化成甲硫氨酸。所有这三家生产商都计划增加甲硫氨酸的生产设备并与原料生产相结合(Chem. Marketing ReporterApril 7，2003)。对大量生物体的甲硫氨酸的生物合成途径(天冬氨酸家族成员)的研究显示出相似和差异。最初确定的反应步骤为高丝氨酸在高丝氨酸酰基转移酶(homoserineacy I transferase)的催化作用下发生酰化反应，除了发生转移的酰基有所不同，它普遍存在于所有生物体中。metA催化作用的产物为乙酰高丝氨酸或琥珀酰高丝氨酸。乙酰高丝氨酸随后通过转硫途径或定向巯基化途径转化为高半胱氨酸。两种途径都被报导存在和作用于酵母、真菌、绿色植物和棒状杆菌属(Corynebacterium glutamicum)的细菌中。大肠杆菌(E. coli)仅采用转硫途径。转硫途径以胱硫醚作为中间产物并由半胱氨酸作为硫供体。定向巯基化途径包括将硫化物直接整合到酰基高丝氨酸。该途径中的最后一步为高半胱氨酸在高半胱氨酸转甲基酶(homocysteine methyltransferase,由metE或metH基因编码)的催化作用下转化为甲硫氨酸。其它用于动物饲料的重要的氨基酸，如赖氨酸、苏氨酸和色氨酸通过发酵制备。因此，这些氨基酸可由葡萄糖和其它再生资源作为起始物质生成。遗憾的是通过发酵的方法生产甲硫氨酸并不成功，至今仍采用甲硫氨酸的化学合成。这其中部分原因是由于缺少有效构建的生产甲硫氨酸的生物合成途径及生产甲硫氨酸的合适生产宿主。下面公开了改良的甲硫氨酸生物合成途径及其生产宿主。
技术实现思路
概述通过发酵的方法生产甲硫氨酸及相关产物如S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAMe)的过程在此描述。基因工程化的含有重组DNA分子并生产甲硫氨酸的微生物也描述于此。本专利技术描述了含有具有定向巯基化活性的外源核酸序列编码的肽(EC 2. 5. I. 49，EC 4. 2. 99.-)，并含有具有转硫活性的内源核酸序列编码的肽(EC 2. 5. I. 48和4. 4. I. 8)的微生物。该微生物能产生甲硫氨酸及相关产物。在一些例子中，该微生物能产生至少O. 1，I，2，5，10，50，75，90或100g/L胞外浓度的甲硫氨酸或SAMe。在一些例子中，存在不止一种甲硫氨酸的生物合成途径，较之在缺少外源核酸序列(其编码的肽具有定向巯基化活性)的条件下，允许生物体产生更多的甲硫氨酸。在其它的例子中，在生物体中活跃着两种以上的甲硫氨酸生物合成途径。在这些例子中，一个或多个外源核酸序列编码的肽具有定向巯基化活性。其中的一种肽能够以O-琥珀酰高丝氨酸作为底物，另一种肽能够以O-乙酰高丝氨酸作为底物。在一些例子中，构建的产甲硫氨酸及相关产物，如SAMe的微生物，所产生的至少10%的甲硫氨酸来自于转硫生物合成途径。在另一些例子中，它们产生的至少20，30，40或 50%的产物来自于转硫生物合成途径。在一些例子中，构建的产甲硫氨酸及相关产物，如SAMe的微生物，由定向巯基化生物合成途径活性，产生至少10%的甲硫氨酸。在另一些例子中，它们由定向巯基化生物合成途径，产生至少20，30，40或50%的产物。在一些例子中，构建产甲硫氨酸及相关产物的微生物，以减毒由基因如metD，metK, metj, thrB, serA编码的肽或其制品的活性。在另一些例子中，微生物还被构建成过表达一个或多个基因，如 metA, metB, metC, metE, metY, metZ, metX, metH, cysPWUA, cysD,cysN, cysC, cysH, cysl, cysj, cysG, csyK 和 cysM。本专利技术还提供生产甲硫氨酸和SAMe的方法。这些方法包括培养构建的生产甲硫氨酸及相关产物的微生物并分离产物。在一些例子中，微生物可以是大肠杆菌(E. coli)，假单胞菌属(Pseudomonas sp.)或棒状杆菌属(Corynebacterium glutamicum.)。在此还描述了新的核酸序列及相应的氨基酸序列(SEQ ID N0S: I和2)。这些核酸序列和片段以及这些核酸序列的可用于在重组微生物中产生肽。这些肽用于产生甲硫氨酸和SAMe。这些肽及其变化形式和其片段还用于产生专门的结合剂，如抗体。省略中间产物磷酸腺苷酰硫酸(phosphoadenylylsulfate, P APS)改善硫的同化过程的方法也描述于此。该方法可用于任何产甲硫氨酸的微生物。该方法是通过在微生物中引入重组的核酸序列，其允许一个或多个腺苷酰硫酸还原酶(adenylyl sulfatereductases) (ECI. 8. 99. 2或I. 8. 4. 9)的过量表达。过量表达可以通过引入改变的重组核酸序列，或通过引入新的控制因子，如启动子或增强子，其增强了内源腺苷酰硫酸还原酶的表达或增强了编码腺苷酰硫酸还原酶的重组核酸序列的表达。通过下面的详细描述和具体实施例，本专利技术及其它方面是显而易见的。附图说明图I表明各种微生物产甲硫氨酸的三种途径。所有的途径都部分依赖于采用天冬氨酸作为生产甲硫氨酸的起始物质。天冬氨酸经过多步反应转化为高丝氨酸，高丝氨酸通过MetA或MetX转化为O-乙酰高丝氨酸或0_琥珀酰高丝氨酸。一些微生物，如大肠杆菌和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)利用MetA多肽产生0_琥拍酰高丝氨酸,而其它微生物,如棒状杆菌属和钩端螺旋体属(Corynebacterium和Leptospira sp.)利用MetX产生O-乙酰高丝氨酸。O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸随后通过巯基化途径完全转化为高半胱氨酸，或者通过转硫途径转化为高半胱氨酸(两个反应均在此处做详细描述)。与转硫途径有关的酶以**表不，与疏基化途径有关的酶以*表不。图2表示甲硫氨酸在TF4076BJF中的累积量，仅通过转硫途径表达(TF4076BJF)，仅通过巯基化途径表达(TF4076BJF-A)，或由两种途径同时表达(TF4076BJF metYX(Lm)。图3示意性表示用于识别反馈抑制抵抗剂metA基因突变体的筛选方法(每个例子中的产品表达以阴影椭圆标出)。图4表示甲硫氨酸的表达受到反馈抑制抵抗剂metA基因的抑制随时间变化的曲线。 图5表示大肠杆菌中甲硫氨酸的转运模型。图6表明天然的硫同化途径及新的备选的硫同化途径。序列表序列表中所示的核酸及氨基酸序列采用标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的的分离多肽，与具有如基因库登录号No. AAC76983所述的氨基酸序列的野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽相比，其通过L-甲硫氨酸显示对反馈抑制的敏感性降低。2.根据权利要求I所述的分离多肽，其在对应于野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽的氨基酸 24，29，79，114，140，163，222，275，290，291，295，297，304 和 305 的一个或多个氨基酸位置含有突变。3.根据权利要求2所述的分离多肽，其在对应于野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽的氨基酸163，222和295的一个或多个氨基酸位置含有突变。4.根据权利要求2所述的分离多肽，其在对应于野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽的氨基酸24，275，297和305的一个或多个氨基酸位置含有突变。5.根据权利要求2所述的分离多肽，其在对应于野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽的氨基酸290的氨基酸位置含有突变。6.根据权利要求2所述的分离多肽，其在对应于野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽的氨基酸29，114和140的一个或多个氨基酸位置含有突变。7.根据权利要求2所述的分离多肽，其在对应于野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽的氨基酸79，140，291和304的一个或多个氨基酸位置含有突变。8.根据权利要求2所述的分离多肽，其中24位的氨基酸苏氨酸被丝氨酸替换；29位的氨基酸丝氨酸被脯氨酸替换；79位的氨基酸天冬酰胺被丝氨酸替换；114位的氨基酸谷氨酸被甘氨酸替换；140位的氨基酸苯丙氨酸被丝氨酸或异亮氨酸替换；163位的氨基酸赖氨酸被谷氨酰胺替换；222位的氨基酸苯丙氨酸被亮氨酸替换；275位的氨基酸丙氨酸被谷氨酸替换；290位的氨基酸天...

【专利技术属性】
技术研发人员：布莱恩·布鲁泽，张眞淑，赵光命，赵英郁，默文·德苏泽，霍利·J·杰森，金素影，牛伟，费尔南多·A·桑切斯列拉，申容旭，严惠媛，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：