一种基于表面等离子共振的种质资源中特定DNA序列资源的鉴定方法，属于种质资源鉴定技术领域。本发明专利技术包括传感表面适配体固定、样品标记、样品鉴定、传感元件再生四个步骤，利用同一传感芯片对不同DNA序列进行鉴定；其特征在于以免疫球蛋白E作为标记分子探针，将传感芯片表面连接免疫球蛋白E适配体；对食品样品进行一系列预处理，加入单链DNA的免疫球蛋白E标记物，混合后竞争结合金属纳米粒子修饰的单链DNA相应的适配体；利用表面等离子体共振检测仪检测免疫球蛋白E的含量，间接鉴定特定单链DNA序列；并对传感芯片进行再生，用于检测其它特定DNA序列。本发明专利技术提供了一种种质资源中特定DNA序列的有效鉴定方法，实现了同一表面等离子体共振传感芯片对不同DNA序列的鉴定，具有极高的通用性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种种质资源中特定DNA序列鉴定技术，特别是基于表面等离子共振技术，核酸适配体与未标记和标记的样品特异性竞争识别，采用免疫球蛋白E修饰的传感元件间接鉴定种质资源中特定DNA序列的方法。
技术介绍
种质资源是国民经济可持续发展的基础性战略资源。然而，近年来，我国种质资源流失严重，一方面我国拥有的人类遗传资源、重要经济作物资源、药用资源、工业微生物资源等通过非正当途径大量流失到国外；另一方面一些发达国家在我国建立植物提取物粗加工基地，掠夺性地从我国引进优等药材和资源性提取物。此外，长期以来，我国种质资源鉴 定通常是根据形态标记来进行的，如株高、穗长、粒色等。此种形态标记简单直观，但存在数少、多态性差、易受环境条件影响等缺点。因此，导致我国种质资源保护工作面临着巨大的挑战，严重缺乏能满足巨大数量和多种类型物种资源检测鉴定的分析技术。近10年来，在人类基因组研究计划的推动下，结合现代检测鉴定技术，分子标记的研究与应用得到了迅速的发展。荧光定量PCR技术可以通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，但该技术目前并不能准确地鉴定种质资源；而建立在PCR基础上直接测序的方法，成本昂贵，无法实现快速高通量检测鉴定。可以说，在物种遗传标记等真实性检测鉴定技术方面我国基本处于空白状态。以表面等离子体共振谱仪为技术平台，可以为种质资源中特定DNA序列的快速鉴定提供一种简便可靠的方法，大大缩短了检测鉴定时间，有望发展成为种质资源鉴定的标准化检测平台。但其存在传感芯片检测专一性和成本高问题。例如，采用表面等离子体共振原理检测的仪器BIACore，其常用传感器芯片SA芯片成本为3000多元人民币。因此，如何实现同一传感芯片检测不同特定DNA序列已成为表面等离子体共振检测领域热点研究问题。
技术实现思路
为了解决现有特定DNA序列分析技术存在的耗材量大、造价昂贵等问题，同时满足对种质资源中各种DNA序列的鉴定要求，本专利技术提供了一种种质资源中特定DNA的表面等离子体共振鉴定方法。该方法具有通用、高稳定性、高灵敏度、操作简单等优点，满足对种质资源中特定DNA序列的鉴定要求。本专利技术的技术方案为一种应用表面等离子共振仪的种质资源中特定DNA序列鉴定方法，利用同一传感芯片对不同种质资源中特定DNA序列进行鉴定；其特征在于包括以下步骤 (一)传感芯片表面适配体固定选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入5-50 μ L浓度为1-50 μ g/L已标记生物素的免疫球蛋白E适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上免疫球蛋白E适配体；(二)对特定单链DNA进行免疫球蛋白E标记，标记方法根据待测物基团不同；所述标记方法包括DNA的对苯二异硫氰酸酯修饰和与免疫球蛋白E的氨基偶联。如将水稻一段SSR单链与对苯二异硫氰酸酯反应后，再与免疫球蛋白E的氨基偶联，形成通过对苯二异硫氰酸酯连接的免疫球蛋白E-SSR序列偶联物，待用； (三)标准溶液配制用O.01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸盐缓冲液配置免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液，浓度为O. Ing/mL至lmg/mL,加入等量特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体充分混合，获得特定单链DNA标准溶液，其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还可以大于加入的适配体量； (四)建立对照曲线采用表面等离子共振谱仪测量，以O.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准，通过微泵通入5-100 μ L特定单链DNA标准溶液，记录下表面等离子体共振仪光谱图，获得特定单链DNA表面溶液的表面等离子体共振谱图稳定值A ； (五)检测鉴定提取种质资源总DNA，进行不对称PCR扩增反应，获得单链DNA;对于待测单链DNA样品进行一系列预处理，取待测单链DNA溶液与免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液充分混合后，竞争结合特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还不少于加入的适配体量；采用表面等离子体共振检测仪记录待测单链DNA的光谱图；通过检测免疫球蛋白Ε，间接鉴定特定DNA是否存在；对比待测单链DNA样品的谱图稳定值B与特定单链DNA的谱图稳定值Α，当B小于A时，说明种质资源中含有特定DNA序列，当B等于A时，说明不含有特定DNA序列； (六)通入O.01-0. 05mol/L (pH为2_3)的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，冲洗传感芯片表面，进行传感元件再生，用于其它种质资源中特定DNA序列的鉴定。可以采用核酸适配体为识别分子，核酸适配体序列与待测物直接相关。所述步骤(一)传感器表面适配体固定，包括如下步骤 (1)将链霉亲和素SA修饰的传感芯片插入表面等离子体共振检测仪中，在工作通道中进行在线传感表面修饰； (2)通入O.02mol/L (pH = 7. 4)的磷酸盐缓冲液； (3)通入5-50μL浓度为1-50μ g/L生物素修饰的免疫球蛋白E适配体溶液，进行在线偶联至基线稳定； (4)重复步骤(2)至(3)，获得免疫球蛋白E适配体修饰的传感芯片。可以采用免疫球蛋白E标记待测物，与未标记样品一起与核酸适配体发生特异性竞争识别。所述步骤(三)中纳米粒子可以是金属纳米粒子或磁性纳米粒子或高分子化合物。所述步骤(四)和(五)中通过检测免疫球蛋白E的含量，间接鉴定特定DNA是否存在，提高表面等离子体传感芯片的可重复利用性，适用于各种种质资源中特定DNA序列的检测。本专利技术的有益效果 (I)本专利技术解决种质资源中特定DNA序列鉴定芯片的专一性差问题，引入免疫球蛋白E作为标记分子，采用生物素标记的适配体对表面等离子体共振传感芯片进行修饰，将种质资源中特定DNA序列的鉴定转换为对免疫球蛋白E的测量，实现传感芯片的通用性，使用同一传感芯片对种质资源中不同特定DNA序列进行鉴定。具体检测原理见附图I ;(2)本专利技术解决芯片稳定性差问题，采用适配体作为芯片表面通用配体，再生容易。可重复使用性强，极大地延长了芯片的使用寿命，降低检测成本； (3)本专利技术解决试剂消耗量大问题，采用待测样品中DNA序列和免疫球蛋白E标记的特定DNA序列竞争识别特定DNA的适配体时，相对于以往的竞争抑制结合思想，无须加入过量的适配体，既实现了响应信号放大，也节省了试剂消耗； (4)本专利技术提高了检测灵敏度，操作中可选用纳米粒子修饰的特定DNA适配体，基于表面等离子体共振检测时，信号显著增加。 附图说明图I是本专利技术所述的种质资源中特定DNA序列鉴定原理图；其中 为特定DNA序列，为样品中待鉴定DNA序列，b为免疫球蛋白E标记的特定DNA序列J为特定DNA的适配体，_为免疫球蛋白E的适配体， 为纳米粒子。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作以详细描述。实施例选择水稻显性早熟基因Ehd的一段SSR序列为鉴定对象，具体操作步骤如下 (1)传感器表面适配体固定选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入20μ L浓度为30 μ g/L已标记生物素的免疫球蛋白E适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上免疫球蛋白E适配体； (2)水稻显性早熟基因Ehd特定SSR序列和免疫球蛋白E偶联将特定SSR单链与对苯二异硫氰酸酯反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王利兵，于艳军，苏荣欣，
申请(专利权)人：王利兵，
类型：发明
国别省市：
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