一种利用蛹虫草液体发酵生产纤溶酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用蛹虫草的液体发酵生产纤溶酶的方法，(1)将蛹虫草菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，然后转接到种子发酵培养基中，进行种子培养，得种子液；(2)将种子液按5～15％的体积比接种于液体发酵培养基中，液体发酵培养20～30h，然后加入扩张蛋白溶液，继续培养120～168h，分离去除蛹虫草菌丝体得纤溶酶发酵上清液；(3)从纤溶酶发酵上清液中提取蛹虫草胞外纤溶酶，即得蛹虫草纤溶酶。本发明专利技术将植物扩张蛋白和优化后的发酵方法应用于蛹虫草纤溶酶的液体发酵生产，大幅度提高了虫草纤溶酶的液体发酵产量，使产量达到每升发酵液93270U，是传统发酵生产方法产量的2.69倍以上，具有极好的工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用蛹虫草的液体发酵生产纤溶酶的方法，属于生物发酵工程

技术介绍
血栓栓塞性疾病是当前危害人类健康、导致死亡率最高的疾病之一，包括急性心肌梗死、缺血性心脏病、心血管疾病、心脏瓣膜病、周边血管疾病、心律失常、高血压、脑栓塞、肺栓塞等。日渐成胁着人类的健康。根据发表在美国心脏协会的《循环心血管质量与结果》杂志上的一项研究预计，仅仅由于2010年到2030年的衰老和人口增长，世界范围内的年心血管疾病发病率将增长50%。目前治疗血栓栓塞疾病的最为有效并且可靠的手段是溶栓疗法，因此，溶栓抗栓药物的研制开发已成为国内外研究热点之一。目前用于血栓性疾病治疗的药物都不同程度具有纤维蛋白特异性差、体内半衰期短、生产成本高、需大剂量连续用药等缺点。于是国内外专家学者逐渐将目光投向寻找一些安全性好、副作用小、疗效好的天然来源的溶栓药物。虫草菌是我国传统名贵中药，属子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycetes)、幾壳菌亚纲(Sordariomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草菌属(Cordyceps Frey Link.),是一种虫生真菌。在民间，常常被称为冬虫夏草。药理学研究表明在增强免疫力、抗肿瘤、抗细菌和抗真菌等方面具有良好功效。蛹虫草(Cordyceps militaris)因与冬虫夏草的活性成分上有着相似的生化结构和药用功能，近年来备受各界关注。由于对蛹虫草的需求增长迅速，野生蛹虫草资源被疯狂采摘而日益稀缺，因此其广泛应用受到药源资源的严重制约。研究发现，通过液体发酵生产与从蛹虫草子实体、菌丝体中直接提取得到的虫草纤溶酶等活性成分在生化结构、生理作用上基本是相同的，而且具有培养周期短、生产流程易控制、活性物质易于提取等优点，已有报道蛹虫草的纤溶酶等活性物质的提取含量及效率都要远高于利用人工栽培虫草进行生产和提取。但是目前的蛹虫草液体培养研究和应用仍是起步阶段，许多发酵技术和工艺仍不成熟，整体产量和发酵水平较低，限制了其工业化生产的发展。扩张蛋白是在植物细胞壁中发现的一类新蛋白种类。研究表明，扩张蛋白几乎参与了植物的整个发育过程除具有增大细胞的功能外，扩张蛋白在细胞生长、种子萌发、根毛形成、根系生长、叶原基形成、叶子生长发育、果实成熟、器官脱离，以及花粉管生长方面起着重要的作用。在拟南芥、番茄、草莓、棉花、水稻和玉米等多种植物中均已发现扩张蛋白，被认为其普遍存在于各种双子叶和单子叶植物的细胞壁中。试验表明扩张蛋白是一类细胞壁酶蛋白，能够通过打断细胞壁多聚物之间的氢键诱导酸依赖的细胞壁延展和压力松弛，进而可能还是在植物生长过程中起生理调控和细胞壁延伸过程中的一个重要调控因子。然而，关于扩张蛋白的作用机制目前仍未有明确定论，将扩张蛋白应用于食药用菌蛹虫草的液体发酵进行纤溶酶等次生代谢产物的生产，国内外目前均未见报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种利用扩张蛋白进行提高蛹虫草液体发酵生产纤溶酶产量的方法。本专利技术技术方案具体如下一种利用蛹虫草的液体发酵生产纤溶酶的方法，包括如下步骤(I)将蛹虫草菌种接种到H)液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数10 15%的接种量转接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为温度 20 25°C，摇床培养24 72h，得种子液；(2)将步骤(I)制得种子液按5 15%的体积比接种于液体发酵培养基中，在温度20 25°C的条件下，液体发酵培养20 30h，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为I. O 3. 5mg/mL，然后继续培养120 168h，分离去除蛹虫草菌丝体得纤溶酶发酵上清液；(3)从步骤(2)制得的纤溶酶发酵上清液中提取蛹虫草胞外纤溶酶，即得蛹虫草纤溶酶。根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中的ro液体发酵培养基，每升组分如下马铃薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至1000mL。根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中的活化培养条件为摇床转速100 160r/ min，温度20 25 °C，暗培养活化24 72h。根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中的种子发酵培养基，每升组分如下3g葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0. 03g CaCl2,0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5颗直径3 6_的玻璃珠。经种子发酵培养基培养后，菌球数量可提高60%以上、菌球直径缩小40%以上，菌丝松散均匀。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中的液体发酵培养基，每升组分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、3g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0. 03g CaCl2,0. 3 g KH2PO4'O.3 gK2HP04。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为I. 5 3. 5mg/mL ;进一步优选的，扩张蛋白的浓度为I. 5 3. Omg/mL ;最优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为 2. Omg/mL ο所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液可参照现有技术制备,如采用McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall extension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 中的记载的方法制备；也可以按照如下方法制备扩张蛋白溶液将蚕豆或黄瓜种子经0. 05 0. 15wt% HgCl2消毒4 6min，流水冲洗5 7h，栽入湿蛭石，25 28°C暗培养4 6天；剪取幼苗上胚轴或根系4 5cm，置_20°C预冷I 2h,加预冷至O 4°C的匀浆缓冲液匀浆后，用孔径60 80 μ m的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置I 3h，得静置液；向静置液中加入提取液，O 4°C下提取24 30h，过滤，按0. 3 0. 5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加 (NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置24 30h， 4°C条件下25000g离心5 IOmin,沉淀用酸性缓冲液复溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析，透析液经20000g离心5 lOmin，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。上述扩张蛋白溶液制备方法中，所述匀浆缓冲液组分为25mmol/LHEPES(4-羟乙基哌嗪乙横酸)，3mmol/L Na2S2O5, Immo 1/L EDTA (乙二胺四乙酸)，O. Iwt % Triton X-100, pH 7. O ;所述提取液组分为25mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，I. Ommol/L EDTA,3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/L NaCl，pH 6. 8 ;所述酸性缓冲液配制是将2. 05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节PH至4. 0，水定容至1L。根据本专利技术优选的，步骤(2)中所述的分离是在4°C 12000r/min条件下离心分离 10 15min。根据本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚强，宫志远，单洪涛，韩建东，王琦，高能，孙涛，任鹏飞，万鲁长，任海霞，李瑾，
申请(专利权)人：山东省农业科学院农业资源与环境研究所，
类型：发明
国别省市：