本发明专利技术涉及一种是用于预防仔猪水肿病的stx2e毒素亚单位灭活疫苗的制备方法。本发明专利技术是用产类志贺氏毒素II型变异体(stx2e毒素)的大肠埃希氏菌，接种于适宜培养基培养，提取stx2e毒素亚单位抗原，灭活后与油佐剂混合乳化制成。用于预防仔猪水肿病。本发明专利技术所涉及的仔猪水肿病的stx2e毒素亚单位灭活疫苗使用剂量小，免疫效力高，安全性好，对仔猪的生长没有任何不良影响，为防治仔猪水肿病奠定了坚实的基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种仔猪水肿病毒素亚单位灭活疫苗的生产方法，属于生物
，特别是属于兽用生物制品行业。
技术介绍
仔猪水肿病是严重阻碍着养猪业发展的常见疾病之一，其发病急，死亡快，死亡率极高，发病后往往来不及治疗就死亡，常造成养殖业主较大经济损失。经过几十年的深入研究，人们对水肿病的发病机理有了比较详细的了解，明确了仔猪水肿病的发生与产类志贺氏毒素II型变异体(stx2e毒素)的大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的两个致病因子 ~F18ab 菌毛和 stx2e 毒素密切相关(Imberechts H, De Greve, Schlicker C, et al. Characterization of F18 fimbrial genes fedE and fedF involved in adhesion and length of enterotoxemic Escherichia coli st rain F107/86. Microb Pat hog S印，1996,21 (3) :183-192.) o F18ab菌毛为黏附因子，可黏附于小肠绒毛膜上从而使细菌得以定居，并大量分泌stx2e毒素，该毒素是仔猪水肿病的直接致病因子，该病的临床症状和病理变化均由其引发。stx2e毒素是一种蛋白外毒素，不但具有很高致病性，也具有很强的免疫原性，用其制备灭活疫苗可以有效预防仔猪水肿病的发生(Wieler L H, Franke S，Menge C，et al. Investigations on the immunoresponse during edema disease of piglet s after weaning by using a recombinant B subunit of shiga21ike toxin II e.Dtsch Tierarztl Wochenschr, 1995，102 :40-43.)。stx2e毒素是一种高致病性毒素，临床分离株往往只需分泌少量的毒素就足以对仔猪致病，甚至致死，因此临床分离株在人工培养条件下往往很难大量培养出该毒素。我们对原用于产志贺氏菌菌素的培养基进行改进，对培养基的组份和成分含量进行优化，大大提高了培养基产stx2e毒素的产量和产毒效率，所生产的stx2e毒素毒性高，灭活后免疫原性强，这为制备高效的预防仔猪水肿病的stx2e毒素亚单位疫苗奠定了坚实的基础。在此基础上，我们进行了仔猪水肿病毒素亚单位疫苗的研制工作。研制结果表明， 我们研制的亚单位疫苗使用剂量小，免疫效力高，安全性好，对仔猪的生长没有任何不良影响，为防治仔猪水肿病奠定了坚实的基础。
技术实现思路
一、生产用菌株I.菌株来源制造和检验用仔猪水肿病的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株由本申请人分离、鉴定、保存和供应，该菌株已于2011年11月22日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为 CGMCC No. 5484。2.菌株特点(I)形态和生化特性本菌株为革兰氏阴性杆菌，两端钝圆，大小为0.4 O. 7umX2 3um;能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖，产酸产气，IMViC试验(吲噪、甲基红、V-P、枸橡酸盐试验)反应为-、+、-、-。(2)培养特性菌种在SB固体培养基上，36 37°C培养20小时，菌落光滑、圆整、湿润，直径I 2mm。在SB液体培养基中，36 37°C培养20小时，呈均匀一致混浊。(3)血清学特性用O抗原定型血清进行血清型鉴定，应为0139。(4)stx2e毒素毒力鉴定以本菌所提取的stx2e毒素，静脉注射25 40日龄仔猪， O. 03mg/头，或腹腔注射体重20g左右昆明小鼠，O. Olmg/只，可使所有试验仔猪或小鼠发生以后肢瘫痪、共济失调为特征的神经症状，甚至死亡。二、stx2e毒素亚单位疫苗的制备方法I生产用种子制备将大肠埃希氏菌EDQD株(由青岛易邦生物工程有限公司分离、 鉴定、保存)冻干的菌种接种改良SB液体培养基(见附件I)，接种固体琼脂平板，挑取典型菌落若干，经PCR鉴定毒素基因合格后(见附件3)，即可用于接种。2菌液培养采用发酵培养法对大肠埃希氏菌EDQD株进行培养，发酵培养基为改良SB培养基。3毒素提取采用不同饱和度硫酸铵沉淀方法进行毒素提取。提取毒素重悬与原菌液体积1/20,经Bradford法(见附注2)测定蛋白含量，以灭活毒素蛋白含量彡48mg/ml为合格。经戊二醛溶液灭活后，置2 8°C保存备用。4水相配制取灭活检验合格的stx2e毒素液，调整蛋白浓度至48mg/ml，按4%终浓度加入灭菌的吐温-80，加入配液罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。5油相制备取注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸铝I份加入油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，125°C加热30分钟，冷却后，导入贮油 te中备用。6疫苗乳化取油相2份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相I 份，再以4000r/min搅拌40分钟。乳化后，取样IOml,以3000r/min离心15分钟，若有分层现象，应重复搅拌I次。具体实施例方式本专利技术的实施例进行具体说明I生产用种子制备I. I 一级种子繁殖与鉴定将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株(CGMCC No. 5484)冻干菌种接种于SB固体培养基(见附件I)，37°C培养18小时，挑取光滑圆整的单个菌落，接种于SB液体培养基中，37 °C振荡(摇床转速150r/min左右)培养15小时左右。无菌取少量菌液进行stx2e毒素基因的PCR鉴定，如可扩增出特异性基因片段且纯检合格，则向菌液中按15%终浓度加入甘油，混匀后小量分装，作为一级种子。在_20°C以下保存，使用期不超过6个月。I. 2 二级种子繁殖取一级种子融化后，按1%比例接种于SB培养基中，37°C振荡 (摇床转速150rpm左右)培养15小时左右。无菌取少量菌液进行stx2e毒素基因的PCR 鉴定，如可扩增出特异性基因片段且纯检合格，即可用于扩大培养。在2 8°C保存，应不超过7天。2制苗用stx2e毒素的制备2.1细菌培养按以下条件进行发酵培养二级种子接种量为3%、通气流量为 200L/分、搅拌速度为150r/min培养时间为5 7小时、培养温度为36 37°C、消泡剂为 O. 1%花生油。2. 2 stx2e毒素的提取收获的菌液经连续流离心机离心，菌泥按O. I克/ml比例重新悬浮于生理盐水中，于冰裕条件下在超声波破碎仪上作用至90%以上菌体破碎。破碎菌液经连续流离心机离心，取上清于4°C搅拌条件下，缓慢加入将固体硫酸铵直至达到40% 硫酸铵饱和度，继续搅拌2小时，于4°C经连续流离心机离心，弃去沉淀物，于上清中继续加入固体硫酸铵至达到60%硫酸铵饱和度，继续搅拌2小时，于4°C经连续流离心机离心，沉淀重悬与原菌液体积1/20，经戊二醛溶液灭活后，置2 8°C保存备用。2.3 stx2e毒素提取物毒力试验以本菌所提取的stx2e毒素，腹腔注射体本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜元钊，郭玉广，邹敏，马爽，程增青，冯阳，王福军，李金积，郭莉莉，孙健，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。