改善的人长五聚环蛋白3表达系统及其用途技术方案

本发明专利技术涉及包含在有效启动子控制下的编码人长五聚环蛋白PTX3的核苷酸序列和编码可选择标记的核苷酸序列的真核表达载体、能够提供由该载体编码的蛋白质表达的重组人细胞和用于生产人长五聚环蛋白PTX3的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能够表达高水平人五聚环蛋白3(hPTX;3)的源自人的细胞系统、所用的方法和材料。
技术介绍
人长五聚环蛋白3，PTX3或hPTX3 (GeneBank登录号BD131701)，是一种由二硫键连接的8个亚基组成的多聚体糖蛋白。本专利技术的作者已经设计了用于在HEK293F人细胞系中生产PTX3的表达系统。该系统基于含有新霉素抗性基因的质粒，其中PTX3基因在人遍在蛋白C启动子序列的控制下。 此系统避免了源自非人源细胞系内源产生PTX3的嵌合PTX3的潜在形成。在所获得的那些生产克隆当中选出最佳的生产分离克隆，名为2F12。获得了约20mg/L PTX3的产量，这对商业生产需要而言是不够的。为增加PTX3表达水平，本专利技术的作者已经构建其中PTX3基因在CMV启动子控制下的质粒。该质粒用来再转染表达PTX3的克隆2F12。在新的分离转染瘤(transfectoma) 中检测到的生产率水平高于预期，约80mg/L。专利技术描述使用实验策略获得表达高水平人PTX3的人源克隆，所述实验策略包括以下步骤a)构建携带在CMV启动子控制下的人PTX3的质粒表达盒；b)在所述质粒中插入潮霉素抗性盒，以选择稳定的转染瘤，所述转染瘤源自G418 抗性的PTX3表达克隆的再转染；c)验证表达的重组蛋白的身份(identity)和水平；d)生物化学表征重组hPTX3。PCT/EP2009/050937的内容因而通过引用的方式并入。本专利技术的目的是基本上具有SEQ ID 1的序列的真核表达载体，其包含在有效启动子控制下的编码人长五聚环蛋白PTX3的核苷酸序列和编码可选择标记的核苷酸序列。该载体优选地用来转化宿主细胞，优选地其中宿主细胞是已经能够表达人长五聚环蛋白PTX3的重组人细胞，更优选地其中重组人细胞是在ECACC以编号08011001保藏的重组^3F/PTX3/2F12克隆。在具体的方面，该载体被线性化。本专利技术的另一个目的是能够表达由如上所公开的载体编码的人长五聚环蛋白 PTX3的重组细胞，优选地该重组细胞是重组HEK293F细胞系，更优选地，它是在英国索利兹伯里健康保护署应急准备和响应培养物保藏中心(Health Protection Agency, Culture Collections Centre For Emergency Preparedness and Response Salisbury UK)以编号 09072902保藏的重组MS24PTX克隆。本专利技术的另一个方面是如上文所公开的重组细胞用于生产人长五聚环蛋白Ρ Τ3 的用途。本专利技术的另一个目的是用于生产重组人长五聚环蛋白PTX3的方法，其包括a)用其中人长五聚环蛋白基因在CMV启动子控制下的可选择质粒转染已经表达重组人长五聚环蛋白PTX3的重组人细胞；b)选择并且培育转染的重组人细胞；c)从转染的重组人细胞的培养基纯化人长五聚环蛋白PTX3。优选地，表达重组人长五聚环蛋白PTX3的重组人细胞是重组HEK293F细胞系，更优选地，它是在ECACC以编号08011001保藏的重组^3F/PTX3/2F12克隆。在优选的实施方式中，纯化步骤包括以下步骤的至少一者阴离子交换层析、羟基磷灰石层析或尺寸排阻层析。本专利技术的另一个目的是用于生产重组人长五聚环蛋白PTX3的方法，其包括a)用基本上具有SEQ ID 1的序列的第一载体和用基本上具有SEQ ID 2的序列的第二载体同时或依次地共转染人细胞；b)选择并且培育双重转染的细胞；b)从双重转染的细胞的培养基纯化人长五聚环蛋白PTX3。本专利技术的另一个目的是用于生产重组人长五聚环蛋白PTX3的方法，包括培育重组MSMPTX克隆并且从培养基纯化人长五聚环蛋白PTX3的步骤。现在将具体参考以下附图，借助非限制性实施例说明本专利技术。附图说明图1 :pSASSI_hPTX3图谱和主要特征。图2 (A)MS24PTX克隆和(B) ^3F/PTX3/2F12克隆在转瓶中的生长、存活率和生产率。图3 通过梯度4-15%的SDS-PAGE (A)和尺寸排阻层析法(B)表征从MS24PTX克隆纯化的重组人PTX3。 图 4 :hPTX3 克隆 ^3F/PTX3/2F12 和 hPTX3 克隆 MS24PTX 的 FGF2 结合能力。图5 :pSCl-hPTX3图谱和主要特征。实施例实施例1 克隆 ^3F/PTX3/2F12质粒PSC1-PTX3的构建1. pSG/Ub 的构建1. 1人遍在蛋白C启动子序列的制备通过用PCR扩增，从pUB/Bsd质粒Qnvtrogen,目录号V512-20)取得人遍在蛋白 C启动子。作为克隆策略的一部分，在两个末端引入限制性核酸内切酶的识别序列。在上游扩增引物中构造BsaAI位点并且在下游引物中构造EcoRI位点。扩增的区域对应于pUB/ Bsd序列中的第1941至3161位核苷酸。寡核苷酸设计如下5，ρ UbC 长度26 聚物(SEQ ID 3)ATATCACGTG ATC TGG CCTCCG CGC C3，ρ UbC 长度23 聚物(SEQ ID 4)GGAATTC GGT CCG GTC TAACAA A扩增的方案如下:lng/y1 质粒 DNA，2mM MgC12，0. 2mMdNTP，400nM 每种引物，1 X 供应的缓冲液和0. 04u/ml的Taq DNA聚合酶(Sigma Genosys)；温度曲线(temperature profile) 3 分钟 94°C，30 次(30 秒 94°C，30 秒 46°C，2 分钟 72°C )，5 分钟 72°C，在 4°C冷却直至进一步使用。扩增产物(123^3ρ)通过二氧化硅膜离心柱(NucIeoSpin，Machery-Nagel GmbH&Co.)纯化，在pGEM-T-Easy载体(Promega目录号A1360)中连接，并且转化至大肠杆菌宿主菌株HB2151 (Pharmacia Biotech)中。通过在补充有50mg/l氨苄青霉素的LB培养基上培育选择转化体。通过用^uI加Mel酶的限制性分析检查从氨苄青霉素抗性菌落分离的质粒 DNA (预期 3650和600bp片段)。显示正确限制图谱的质粒通过完整插入物的序列分析进一步检查并且随后用 EcoRI (Sigma-Genosys)和 BsaAI (New England Biolabs)限制酶消化。借助琼脂糖凝胶分离和在二氧化硅膜离心柱上洗脱来纯化人遍在蛋白C启动子。1.2载体片段pSG5的制备质粒pSG5 (4076bp, Stratagene)用限制酶 EcoRI (Sigma-Genosys)和 BsaAI (New England Biolabs)切割；所得的片段长1432和2644bp。将含有pSG5的主链的2644bp片段制备并且借助琼脂糖凝胶电泳加二氧化硅膜离心柱纯化。1. 3pSG/Ub 的制备使用T4DNA连接酶(ftOmega)，将步骤1. 1和1. 2中制备的DNA片段连接并且转化于HB2151大肠杆菌细胞中。通过在补充有50mg/l氨苄青霉素的LB培养基上培育选择转化体。通过用EcoRI加^cII酶的限制性分析检查从氨苄青霉素抗性菌落本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·萨萨诺，A·埃斯普斯托，V·瑞维希奥，G·卡萨尼，
申请(专利权)人：泰克诺根股份公司，
类型：发明
国别省市：