本发明专利技术公开了一株产生纤维素酶的芽孢杆菌属(Bacillus?sp.)菌株和利用此菌株生产纤维素酶的生产方法。经过培养基优化筛选及发酵工艺条件优化控制，确立了稳定的发酵方法，生产的纤维素酶制剂具有良好的酶活性。可广泛用于烤烟醇化、食品加工、饲料加工等行业，并具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及微生物及微生物发酵领域。具体地说，本专利技术涉及一种生产纤维素酶的芽孢杆菌属菌株，纤维素酶以及生产方法。芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株的保藏号为=CGMCC No. 5311，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期2011年9月29日。
技术介绍
纤维素是细胞壁的主要成分，是由葡萄糖通过β_(1，4)糖苷键连接而成的线状大分子聚合物。纤维素酶是一种在分解纤维素时起生物催化作用的酶。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为葡聚糖内切酶(l，4-g-D-glUcan glucanohydrolase 或 endo-1,4_β-D-glucanase, EC3. 2.I.4),葡聚糖外切酶(1， 4_β -D-glucan cellobilhydrolase或exo_l,4_β -D-glucannase,EC. 3· 2· I. 91)和 β -葡聚糖苷酶(i3-l，4-gluCOSidaSe，EC. 3. 2. 1.21)。内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，释放葡萄糖或纤维二糖。β -葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。影响产酶量和活力的因素影响纤维素酶产量和活力的因素很多，除菌种外，还有培养温度、pH、水分、基质、培养时间等。这些因素不是孤立的，而是相互联系的。目前，国内外产纤维素酶菌株容易退化、且发酵要求条件苛刻，生产成本高，不能大规模应用到工业生产。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服上述现有技术缺点，提供一种产生纤维素酶的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)菌株和利用此菌株生产纤维素酶的生产方法。经过培养基优化筛选及发酵工艺条件优化控制，确立了稳定的发酵方法，生产的纤维素酶制剂具有良好的酶活性。本专利技术目的是这样完成的一种芽孢杆菌(Bacillus sp)，其保藏号为 CGMCCNo. 5311，该菌株具有高产纤维素酶的能力。可有效地获得的纤维素酶。利用权利要求I所述的芽孢杆菌(Bacillus sp)菌种生产纤维素酶的发酵培养方法，其特征在于将该菌种接种于LB培养基或其他适合其的培养基中，在温度为10 35°C培养12小时；将分离纯化待测菌株转接到Mastplate平板上的单菌落，再接种到纤维素酶菌株筛选培养基平板上，置于37°C恒温培养箱IOh ；待菌落直径大小约3 6mm时，用O. 2%的刚果红溶液染色2h，然后用5% NaCl溶液脱色lh，然后测量水解圈和菌株直径的大小，计算水解圈和菌株直径的比值，利用进活化筛选出的实验菌株进行发酵培养实验，获得本专利技术的纤维素酶制剂；所述LB培养基成分如下酵母粉5g,蛋白胨IOg,氯化钠10g。在发酵培养过程中，可将菌种直接接种于种子培养基中，然后以I 10%的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养。选择培养温度为10°C 40°C，培养时间为30 75小时，培养的PH值可在4. 5 9.5的生产范围。以下的条件培养温度最好为15 40°C，PH值在5 8范围内更适合于本专利技术的纤维素酶的生产，生产纤维素酶制剂，经上述，优选羧甲基纤维素钠作为碳源，用量为O. 3 1.8% ;优选蛋白胨、酵母膏作为最佳的氮源，用量在O. I I. 5%。由下述方法获得纤维素酶制剂利用过滤法或离心法从培养液中分离菌体和培养基物质，得到上清液或滤液，然后对滤液超滤浓缩等方法最后制得纤维素酶制剂。本专利技术产纤维素酶的菌株可广泛用于烤烟醇化、食品加工、饲料加工等行业，并具有重要意义。附图说明下面结合附图，进一步说明本
技术实现思路
，但并不以此来限定本专利技术。图I :菌株48-1系统发育分析。图2 :不同碳源对菌株48-1产纤维素酶活的影响。图3 :不同氮源对菌株48-1产纤维素酶活的影响。具体实施例方式本专利技术是通过在玉溪烤烟表面分离，纯化和筛选，获得一批产纤维素酶的微生物菌株，从中选出一株编号为48-1的菌株，具有高产纤维素酶的优良性状。经16S rDNA鉴定和生理生化鉴定，属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的菌株，其保藏号为=CGMCC No. 5311。本专利技术在获得芽孢杆菌属(Bacillus sp. )48_1菌株的基础上，提供了该菌株纤维素酶的生产方法，通过利用本专利技术的菌株经过本专利技术确定的具体发酵方法而获得。本专利技术的产纤维素酶菌株48-1可采用如下方法对其进行筛选以及摇瓶发酵以获得本专利技术的纤维素酶制剂。将本专利技术菌种接种于LB培养基或其他适合其的培养基中，10 35°C培养12小时。其LB培养基成分如下酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g。将分离纯化待测菌株转接到Mastplate平板上的单菌落，再接种到纤维素酶菌株筛选培养基平板上，置于37°C恒温培养箱10h。待菌落直径大小约3 6mm时，用O. 2%的刚果红溶液染色2h，然后用5% NaCl溶液脱色lh，然后测量水解圈和菌株直径的大小，计算水解圈和菌株直径的比值。一般说来，比值的大小与菌株降解纤维素能力大小有关。水解圈和菌株直径的比值越大，该菌株降解纤维素的能力越强，分泌纤维素酶的能力也越强，因此计算比值是进一步筛选菌株的较好依据。纤维素刚果红平板透明圈筛选法用于纤维素分解菌酶活力大小的定性试验， 透明圈的大小直接反映了酶浓度的高低。此法决速方便，适合于大量菌株筛选。利用进活化筛选出的本专利技术的实验菌株进行发酵培养实验，获得本专利技术的纤维素酶制剂。在发酵培养过程中，可将菌种直接接种于种子培养基中，然后以I 10%的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养。作为培养基的营养源，可广泛使用通常用于培养的营养源。只要是可作为碳源同化的碳化合物或者含有该碳化合物的，微生物菌种可以利用的，适合于发酵培养产生纤维素酶的碳源即可，例如，可使用葡萄糖、麦芽汁、蔗糖、可用的多糖等。本专利技术中优选羧甲基纤维素钠作为碳源，用量为O. 3 I. 8%。作为氮源，只要是可作为氮源同化的氮化合物或者是含有该氮化合物的即可，例如，可用铵盐、硝酸盐、大豆粉、酵母膏等，其氮源的选择和用量，可依据其他营养源的成分和用量的不同而不同，只要适合本专利技术的纤维素酶产生菌的培养及酶的生产即可。在本专利技术中，优选蛋白胨、酵母膏作为最佳的氮源，用量在O. I I. 5%。对于无机盐类，可适当添加磷酸氢氨，磷酸二氢钾等磷酸盐、镁盐、钙盐、锰盐等盐类，培养条件依据培养基的成分不同而有变化，只要适宜菌体产生本专利技术的纤维素酶即可。通常，可选择以下的条件培养，培养温度为10°C 40°C，最好为15 40°C，培养时间为30 75小时，只要在本专利技术的纤维素酶产量达到最高时结束发酵培养即可。培养的 pH值可在4. 5 9. 5的生产范本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王毅，魏云林，马永凯，唐兴宏，季秀玲，刘永亮，
申请(专利权)人：红塔烟草集团有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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