本发明专利技术公开了一种利用微生物混合菌群对硝基酚同分异构体污染环境的原位修复方法及应用。其步骤是：A、微生物混合菌群的构建:a.配制无机盐培养基：b.菌种的诱导培养c.菌体的收集；B、不同微环境模型的构建：a．土壤微环境模型的构建：b．生物反应器的制备：C、土壤样品置于30℃，生物反应器置于室温，定时取样检测污染物浓度变化。本发明专利技术可以实现40ppm硝基酚每毫克干重土壤的原位修复，以及50毫克每升生物反应器中三种硝基酚的生物修复，并且几种接入菌都可以在土壤和反应器中持续稳定的存在，证明了此种修复方法可以应用到含有硝基酚同分异构体污染的土壤、水体的环境治理中，为环境污染物的治理提供了新的思路。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及环境有机污染物治理
，具体涉及一种利用微生物进行有机污染物的生物修复的方法。更具体涉及利用Alcaligenes sp. NyZ215,Cupriavidus necator JMP134和I^seudomonas sp. WBC-3三种菌株组成混合菌群在三种硝基酚同分异构体污染环境中进行原位生物修复，同时还涉及微生物降解菌群在硝基酚同分异构体原位生物修复中的用途，达到有效去除污染物的目的。
技术介绍
硝基酚(nitrophenols)属于硝基类芳香烃化合物，包括3个同分异构体4_硝基酚(对硝基酚，？-111廿0 1^1101，？肥)、3-硝基酚(间硝基酚，111-111廿0 1^1101，] ^)和2-硝基酚(邻硝基酚，o-nitrophenol, 0ΝΡ)，它们都是重要的化工原料，常作为医药、染料、农药等的合成前体，还广泛应用于光化学品生产过程中和用作生化检测试剂。硝基酚在环境中稳定，水溶性较高，而且自然条件下难以降解，它可抑制许多生物学机能，影响人体物质代谢， 危害人类健康，是重要的环境污染物质之一，其中邻、对硝基酚被美国环境保护署(USEPA) 列为优先环境污染物(Priority Pollutant List)。生物增强(bioaugmentation)跟传统的化学、物理修复相比有很大的优势，最根本特点是消除污染物而不是分离转移污染物，从而在根本上解决环境问题，被誉为21世纪治理环境污染的优选技术，具有广泛的发展和应用前景。有关对硝基酚(PNP)在土壤中的生物修复有一些相应的报道，对于邻硝基酚(ONP)和间硝基酚(MNP)的土壤原位生物修复目前没有相关报道，更没有有关同时降解土壤中存在的三种硝基酚同分异构体的生物修复的报道。在以前相关的报道中，菌株Alcaligenes sp. NyZ215(Xiao Y et al. ,2007, J.Bacteriol. 189 :6587-6593), Cupriavidus necator JMP134(Yin Y et al. , Appl Microbiol and Biotechnol,2010,87 :2077-2085), Pseudomonas sp. WBC-3(Zhang JJ et al.，J Bacteriol, 2009,191 :2703-2710)是分别能以2-硝基酚、3-硝基酚和4-硝基酚为唯一碳、氮、能源生长的微生物。其中WBC-3菌株通过对苯二酚降解4-硝基酚，并伴有亚硝酸根(NO2-)释放；而NyZ215菌株通过氧化途径降解2-硝基酚，中间产物是邻苯二酚， 同时释放亚硝酸根JMP134菌株通过还原途径分解代谢3-硝基酚，中间产物为苯三酚， 并释放铵根(NH4+)。ONP 单加氧酶(0ΝΡ 2-monooxygenase =OnpA), MNP 硝基还原酶(MNP nitroreductase :MnpA)禾口 PNP 单力口氧醇(PNP4-monooxygenase :PnpA)分别是三种污染物微生物代谢过程涉及到的起始酶。菌株Alcaligenes sp. NyZ215 和 Pseudomonas sp. WBC-3 由中国典型培养物保藏中心保藏(CCTCC)，保藏号分别为 M206121 和 M201027，Cupriavidus necator JMP134 由德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)保藏，保藏号为DSMZ4058。在微生物修复研究中，目前，分子生态学研究已经逐渐成为生物修复效果评价标准和监测手段。传统的微生物生态学研究方法(如微生物分离和菌落计数)只限于环境样品中不到可培养的微生物类群，而随着实时定量PCR(Real-time PCR)、 T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism,末端限制性片段长度多态性)、荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)和变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)等技术的出现，研究者可以从群体水平、细胞水平和分子水平对微生物的多样性及其种群结构进行生态学研究。其中， Real-time PCR技术不仅实现了对DNA或RNA模板的定量，而且具有灵敏度高、具实时性和准确性等特点，故可用于监测环境中的目标微生物和目的基因表达情况。这种微生物生态学分析方法，能够检测生物修复过程中微生物生态结构的整体变化，为此类技术的安全性提供证据，并为大面积推广应用提供技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供了一种利用微生物进行有机污染物的生物修复的方法° 利用三禾中菌禾中 Alcaligenes sp. NyZ215,Cupriavidus necator JMP134禾口Pseudomonas sp. WBC-3构建了人工菌群，对土壤、水体环境中的三种硝基酚同分异构体污染物进行生物修复，可以成功的去除土壤和水体中硝基酚污染物的存在，该方法费用低，操作简便，不会形成二次污染。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种利用微生物降解菌群在硝基酚同分异构体原位生物修复中的应用。该操作有效地去除了土壤和水体中硝基酚污染物的存在，针对性强，实施时间相对较短，对周围干扰少，并且降解菌可以在修复的过程中稳定的存在。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施一种利用微生物进行有机污染物的生物修复的方法，其步骤是A、微生物混合菌群的构建三种微生物菌株分别培养，Alcaligenessp. NyZ215 (CCTCC 保藏号 M206121)， Cupriavidus necator JMP134(DSMZ 保藏号 DSMZ4058) ,Pseudomonas sp. WBC-3 (CCTCC 保藏号M201027)的制备方法，包括如下步骤a.配制无机盐培养基成分为磷酸氢二钠(Na2HPO4 · 12H20) 14. 3g，磷酸二氢钾(KH2PO4) 3. Og,硫酸镁(MnSO4 · H2O) 0. 28mg,硫酸亚铁(FeSO4 · 7H20) 0. 3mg,硫酸镁 (MgSO4) 0. 06mg,氯化钙(CaCl2) Img,硫酸铜(CuSO4) 0. 05mg,硫酸锌(ZnSO4) 0. 05mg 和硼酸 (H3BO3) 0. 05mg，将其以双蒸水定容至1000ml，调pH为7. 0，121°C，灭菌20分钟，在250ml三角烧瓶中加入50ml上述无机盐培养基；b.菌种的诱导培养在上述无机盐培养基中分别补加0.5mM 2_硝基酚，3_硝基酚，4-硝基酚，按2 %的接入量分别接入经LB培养基培养的Alcaligenes sp. strain NyZ215, Cupriavidus necator JMP 134，Pseudomonas sp. strain WBC—3，十亘温 30°C培养至对数后期，收集菌液；c.菌体的收集离心收集菌体，用0. 85%生理盐水清洗菌体1-3次；B、微环境模型的构建a. 土壤微环境模型的构建设置了 5组不同土壤处理组A:自然土壤natrual so本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周宁一，迟向群，傅贺，张俊杰，刘虹，王淑君，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：
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