一种分子检测信号放大技术制造技术

本发明专利技术涉及的是一种新的分子检测信号放大技术。其特征在于：将量子点标记的链霉亲和素、抗原、抗体、多肽等，通过酪胺信号放大和银增强染色信号放大形成的一种生物分子高灵敏度检测方法。该检测方法包括以下步骤：待检测的生物分子与固定在固相材料上的核酸、抗体、抗原、多肽等相结合；通过生物分子特异性结合将量子点引入到待测分子上；使用银染试剂对量子点进行银增强染色，使信号放大；所得信号可用普通的光学扫描仪器扫描或普通的成像仪器分析，也可用肉眼观察。本方法一方面实现了生物分子的高灵敏度检测，另一方面降低了生物分子检测的应用成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种分子检测技术。技术背景生物分子包括蛋白质、核酸、脂质、糖类。分子检测方法主要包括析免疫渗滤、免疫层析、生物芯片技术、PCR技术等。其中生物芯片技术又包括包括基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片等，是一项集合了生命科学、微电子学、物理学、化学和材料科学等众多学科的生物高新技术，是高效大规模获取核酸、蛋白质等生物信息的重要手段，在基因表达谱研究、疾病分子检测和大规模药物筛选等众多领域具有广阔的应用前景。目前生物芯片检测普遍使用荧光检测法，使用的材料如Cy3、Cy5、FITC等，直接或者间接标记在DNA或RNA、抗体、蛋白等分子上，产生的荧光信号采用激光共聚焦扫描检测。该方法的缺点是检测灵敏度低、检测仪器价格昂贵，另外荧光信号易饱和、易淬灭、且稳定性差。从而限制了生物芯片的使用，尤其是在中小型医疗机构的推广和应用。量子点(quantum dots, QDs)又称半导体量子点。由II-VI族元素(如硒化镉、 硫化镉等)或III-V族元素(如磷化铟、砷化铟)组成的尺寸< IOOnm的半导体纳米晶体。 量子点具有表面积效应、小尺寸效应、微观量子隧道效应等独特的物理和化学性质，使其具有独特的光学和电学性质。量子点因其颗粒粒径小，比表面积大，表面具有的活性位点多， 量子点存在诸如纳米金、纳米银类似的作为电子传递载体，在还原剂存在下可催化Ag+还原成单质Ag沉积于表面的催化能力。小尺寸效应使量子点颗粒具有很强的催化还原作用，可以将周围的银离子还原成银颗粒；而银颗粒又可以催化还原周围的银离子。这种级联瀑布催化作用使得银颗粒越聚越多，紧紧包裹量子点颗粒积聚成团状银壳，形成几乎肉眼可见的黑色颗粒，用普通的光镜甚至肉眼即可观测。Chou等在观测组织内量子点的分布情况时利用量子点的催化特性，通过组织切片银增强染色法直接定性观测了 Cdk/ZnS量子点在各组织内的分布。同时与荧光成像方法相比较，银染方法更能准确定位量子点的分布情况， 不受生物体内荧光猝灭因素影响，方法快速、直观、简便。许国峰等以人IgG为检测对象，对量子点可视化检测方法进行了研究。TSA(tyramine signal amplification，酪胺信号放大)由 Bobrow 等人于 1989 年提出。TSA的原理是在辣根过氧化物酶的催化下大量酪胺分子沉积。1992年，Adams将TSA 的原理首先引入免疫组化，应用于抗原或者抗体的检测。与常规的生物素-链霉亲和素方法相比，该技术可以将检测灵敏度提高100至1000倍。TSA技术在免疫印迹、酶联免疫等领域已得到了广泛应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对目前分子检测方法中检测信号易饱和、信号稳定性差、检测灵敏度低、检测仪器价格昂贵的问题，提供一种检测信号稳定、检测灵敏度高且不需要昂贵检测仪器设备的检测法。本专利技术提供的技术解决方案是将将量子点标记、酪胺信号放大技术以及银增强信号放大技术相结合的检测方法，将待检测的生物分子与固定在固相上的探针、抗体、多肽、 抗原结合；核酸、抗原、抗体、多肽、蛋白与待检测分子特异性结合；通过生物分子特异性结合将量子点引入到待测分子上；使用银染试剂进行银增强染色，使信号放大；所得信号可用普通的光学扫描仪器扫描分析也可用肉眼观察。本方法一方面实现了生物分子的高灵敏度检测，另一方面实现了生物分子的可视化检测。—种分子检测信号放大技术检测法，其特点包括以下步骤一、基因芯片中的应用1.待测基因的纯化、扩增与标记纯化方法参见分子克隆实验指南(科学出版社， 作者J.萨姆布鲁克)；基因扩增方法采用聚合酶链反应(PCR)或反转录扩增聚合酶链反应 (RT-PCR)；核酸标记方法是对PCR的下游引物采用末端标记法引入生物素，然后进行PCR或 RT-PCR 反应。2.芯片的制备和杂交在醛基修饰的玻璃片上点制所设计探针微阵列；将待检测基因的PCR产物与基因芯片杂交。3.酪胺信号放大过程将已经杂交完成的基因芯片的相应区域加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(Str印tavidin-HRP)。通过靶标上所标记的生物素与链酶亲和素特异性的结合引入HRP ；然后加入生物素标记的酪胺(Biotin-Tyramine)，通过酶催化作用使大量标记生物素的酪胺沉积。4.量子点银染过程在基因芯片的相应区域加入链霉亲和素标记量子点 (Str印tavidin-QDs)。再次利用生物素与链霉亲和素特异性的结合将量子点引入；加入银染色试剂利用量子点小尺寸、催化还原作用，可以将周围的银离子还原成银颗粒；而银颗粒又可以催化还原周围的银离子。形成肉眼可见的检测信号。5.信号处理过程杂交信号可以肉眼观察也可以用普通的光学扫描仪器扫描分析。二、蛋白芯片中的应用1.芯片的制备在醛基修饰的玻璃片上点制抗原或抗体，封闭。2.待测样品与蛋白芯片特异性结合在蛋白芯片的相应区域加入待测样品。3.生物素标记的抗原或者抗体与蛋白芯片特异性结合在蛋白芯片的相应区域加入生物素标记的抗原或者抗体。4.银增强染色信号放大过程在蛋白芯片的相应区域加入链霉亲和素标记量子点(Str印tavidin-QDs)。再次利用生物素与链霉亲和素特异性的结合将量子点引入；加入银染色试剂利用量子点小尺寸、催化还原作用，可以将周围的银离子还原成银颗粒；而银颗粒又可以催化还原周围的银离子。形成肉眼可见的检测信号。5.信号处理；杂交信号可以肉眼观察也可以用普通的光学扫描仪器扫描分析。本专利技术具有以下优点和效果1.本方法提供一种分子检测信号放大技术。该检测方法具有较高的检测灵敏度和特异性。2.本方法检测信号可以用普通的光学扫描仪器扫描分析或肉眼观察，降低了分子检测成本，有利于分子检测技术推广和应用。3.本方法检测信号稳定，有利于结果的保存和比较。 附图说明图1为基因芯片的量子点标记银染可视化检测法示意图。图2为Ev71病毒的检测结果信号扫描图，比较Ev71病毒体外转录RNA模板为 (IO6Copies/ μ L至IO2Copies/ μ L)时杂交信号的强度。图3为轮状病毒的检测结果信号扫描图，比较轮状病毒体外转录RNA模板为 (IO6Copies/ μ L至IO2Copies/ μ L)时杂交信号的强度。图4为科萨齐Β3病毒、科萨齐Β4病毒、科萨齐Β5病毒、脊髓灰质炎1病毒、脊髓灰质炎2病毒、脊髓灰质炎3病毒、艾科30病毒、科萨齐Α16病毒、肠道病毒71型和轮状病毒病毒的检测结果信号扫描图。图5为检测不同乙肝患者血清中的乙肝表面抗原HbsAg。结果信号扫描图。具体实施方式实施实例1检测Ev71病毒和轮状病毒1.自制消化道病毒检测基因芯片。2.将Ev71病毒和轮状病毒细胞培养液，按QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取试剂盒OiIAGEN)说明书操作，得到纯化的RNA。使用反转录试剂盒I^rimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 (宝生物工程有限公司)进行反转录，反应体系为20 μ L :2 X One Step BufferlO μ L^PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0. 8 μ L、0. 2 μ L(上游弓|物，10 μ M)、 1 μ L(下游引物，10 μ Μ)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，张春，刘琪琦，陈苏红，彭贤慧，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：