检测生物样品中的辅酶A分子的方法技术

目的是提供一种检测生物样品中的辅酶Ａ（ＣｏＡ）的高灵敏度和高再现性的方法，其特征在于包括采用强酸性溶液提取生物样品的步骤、固相提取的步骤、添加内标物的步骤以及采用ＬＣ－ＭＳ检测的步骤。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种定量检测生物样品中的辅酶A分子(在下文中记载为“CoA”)的方法。
技术介绍
CoA分子是保持生命功能必不可少的一类化合物，其涉及生物合成途径、脂肪酸的降解和转化、激素合成和调控、TCA循环等。用于精确测量生物样品中的CoA分子的浓度的方法一直是研究的目标，其重点在于这种浓度作为CoA分子在脂质代谢中的功能分析研究的标志的作用。CoA分子之一，丙二酰CoA，是涉及线粒体和脂质合成中的脂肪酸氧化步骤中的脂质代谢机制的组成成分，因此在调控脂质代谢方面扮演了重要的角色；其在调控心脏和骨骼肌肉的脂质能量代谢和脑内下丘脑中的神经肽Y表达，以及在调控饮食摄入和能量消耗方面获得了较多关注。在过去，已提出了用于测定CoA分子的各种方法，包括酶学方法和HPLC。酶学测定方法的例子包括Guynn等人(Guynn，R.W.，Methods Enzymol.，1975，35，312)的方法和McGrry等人(McGarry，J.D.，J.Biol.Chem.，1978，253，22，8291)的方法。例如，当测定的对象为丙二酰CoA时，则测定放射性标记的乙酰CoA或其类似物的丙二酰CoA依赖性吸收。但是，由于其测定目标为一特定的CoA，且在测量过程中由于其他CoA分子的共同存在，从而在某些情况下导致了不精确的测量值，因而必须进行校正，并且该过程也十分复杂，因此该方法具有应用局限性。已经出版了大量的有关采用UV-HPLC测定CoA分子的报道(参见，例如，Hosokawa，Y.，Anal.Biochem.，1978，91，1，370，Demoz，A.，J.Chromatogr.，BBiomed.Appl.，1995，667，1，148)。肌肉、心脏和肝脏生物样品中的CoA浓度通过该方法来测量。但是，由于UV-HPLC具有较低的灵敏度，其对于高度污染的样品，比如那些来源于器官的样品具有较差的再现性，并且脑部浓度特别难于测定，因此需要一种能提供更高灵敏度和再现性的方法。LC-MS作为一种用于获得更高灵敏度的可选择的方法(参见Buchholz，A.，Anal.Biochem.，2001，295，129)被开发出来。该方法通过三维离子阱质谱来实现细胞中的乙酰CoA浓度的测定。虽然采用该方法可成功地对作为检测对象的特定CoA进行检测和峰值分离，但由于该方法为一种绝对校正曲线方法并且不采用内标物，因此其精确度和再现性仍然不足。还有，所述的测定对象为具有低极性且容易通过HPLC分离的乙酰CoA。其另外的测量优势在于细胞样品含有较少量的能干扰测量的污染物中，且样品中乙酰CoA的浓度很高。但是，对于在通过HPLC分离相对较难的高极性形式的情况下，和在样品例如具有很高量的可干扰测量的污染物的动物器官的情况下，和在样品中存在较低浓度的情况下(例如动物器官中的丙二酰CoA)测定CoA分子来说，该方法不能充分地得到应用。本专利技术通过提供一种具有相当好灵敏度和再现性的用于生物样品中CoA分子浓度测定的方法来解决上述问题。本专利技术的公开作为对上述主题深入研究的结果，本专利技术人发现了如下方法。特别地，本专利技术提供了一种用于测定生物样品中辅酶A分子浓度的方法，所述方法的特征在于包括采用强酸性溶液从生物样品中提取的步骤、固相提取的步骤、加入内标物的步骤、和通过LC-MS检测的步骤。本专利技术进一步提供了用于测定辅酶A分子的前述的方法，其特征在于所述的从生物样品中提取辅酶A分子的步骤为一个其中在一种高氯酸溶液中震荡经过冷冻粉碎的生物样品且通过离心分离上清液的步骤。所述的固相提取步骤的特征在于，它是这样的一个步骤其中通过把用强酸溶液提取辅酶A而获得的上清液中和，并且随后加样于采用含有十八甲硅烷基团或辛基甲硅烷基团的硅胶填充的反相柱上，采用水溶液洗涤，再用有机溶剂洗脱。特别地，所述上清是在采用乙腈和1M醋酸铵来再生所述反相柱后加样的，并且洗脱是采用乙腈和醋酸铵的混合物来进行的。本专利技术仍进一步提供了用于测定辅酶A分子的前述的方法，其特征在于所述辅酶A分子为一种脂肪酸辅酶A的酯，并且所述内标物为所述辅酶A分子的结构类似物。本专利技术仍然进一步提供了一种用于测定辅酶A分于的前述方法，其特征在于所述脂肪酸辅酶A的酯为一种在主碳链中含有2-8个碳原子的的短链脂肪酸的辅酶A的酯，所述的结构类似物具有与辅酶A分子相比不多于3个碳原子的差异，且至少3个主链上的氢原子被氘原子所替代，或被13C所替代；且更特别的在于，所述辅酶A分子为丙二酰CoA，且结构类似物为乙酰CoA-d3、甲基丙二酰CoA-d3、甲基丙二酰CoA-d4、丙酰CoA-d3、丙酰CoA-d5或丙二酰CoA-13C3。附图简述附图说明图1为采用来源于Wistar大鼠的肌肉样品检测的色谱图。图2为采用来源于Wistar大鼠的肝脏样品检测的色谱图。图3为采用来源于Wistar大鼠的脑部样品检测的色谱图。实施本专利技术的最佳方式本专利技术涉及一种检测CoA分子的方法，其包括采用强酸性溶液从生物样品中提取，随后如果需要的话，进行浓缩，添加内标物，制备HPLC加样样品，通过HPLC分离CoA分子和内标物，采用质谱仪检测CoA分子和内标物，和通过测得的待检测的CoA和内标物的面积比率进行定量分析。采用强酸性溶液从生物样品中提取CoA分子的步骤可在含有CoA分子的任何生物样品上进行，并且如特定实施例中所提到的，可以是人和动物器官，人、动物和植物的组织或细胞，微生物，及其类似物。测定器官，如肌肉、肝脏和大脑中的CoA分子是特别有用的。作为待检测的CoA分子，可提到具有酰化的巯基基团的酰基CoA分子，具有氧化性键合的巯基基团的氧化的CoA分子，和具有酰化的伯胺的N-酰基CoA分子。虽然在此处提到的一些CoA分子没有在生物样品中发现，但是其可用于研究的目的，如用于功能性分析，因此对于药物开发中的疗效评价十分重要。作为酰基CoA分子的特定实施例，可提到乙酰乙酰基CoA、丙二酰CoA、琥珀酰CoA、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA、戊二酰CoA、CoA、乙酰CoA、苯甲酰CoA、苯乙酰CoA、异丁酰CoA、异戊酰CoA、丁酰CoA、β-甲基巴豆酰CoA、甲基巴豆酰CoA、3-羟基丙酰CoA、巴豆酰CoA、已酰CoA、甲基丙二酰CoA、丙酰CoA、丙烯酰CoA、花生四烯酰CoA、癸酰CoA、反油酰CoA、油酰CoA、棕榈油酰CoA、棕榈酰CoA、亚麻酰CoA、月桂酰CoA、肉豆蔻脑酰CoA、神经酰CoA、硬脂酰CoA、辛酰CoA、肉豆蔻酰CoA、花生四烯酰CoA、十七酰CoA、十九酰CoA、二十六酰CoA、十五酰CoA、β-羟丁酰CoA、庚酰CoA、戊酰CoA、2-丁烯酰CoA和硬脂酰CoA。作为N-酰基CoA分子的特定实施例，可提到N-丁酰CoA、N-癸酰CoA和N-已酰CoA。作为具有氧化性键合的巯基基团的氧化的CoA分子的特定实施例，可提到氧化的CoA和CoA谷胱甘肽二硫化物。在这些中，优选乙酰CoA、CoA、琥珀酰CoA、乙酰乙酰基CoA、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA、丙酰CoA、甲基丙二酰CoA、丙二酰CoA、3-羟基丙酰CoA、丙烯酰CoA、油酰CoA、硬脂酰CoA、亚麻酰CoA、花生四烯酰CoA、棕榈酰CoA、硬脂酰Co本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测生物样品中辅酶Ａ分子的浓度的方法，所述方法的特征在于包括采用强酸性溶液从生物样品中提取的步骤、固相提取的步骤、添加内标物的步骤和通过ＬＣ－ＭＳ检测的步骤。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：酒井满，杉本圭则，
申请(专利权)人：帝人株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]