本发明专利技术公开了一种评价微藻产油能力的方法，该方法包括下述步骤；(1)微藻细胞收集及淬灭；(2)提取细胞内脂肪酸；(3)脂肪酸甲酯化；(4)GC-MS检测；(5)计算日产量；(6)十六烷值确定对微藻产油能力进行评价，本发明专利技术的方法能为比较不同培养体系下不同藻种产油能力提供标准，从而为最优的藻种选择和培养工艺优化提供依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物燃料领域，涉及。
技术介绍
随着科技的发展，人类对能源的依赖程度越来越高，这与日益枯竭的化石能源储备形成了尖锐的矛盾。此外，能源的快速消耗也造成了环境的破坏，大量温室气体，如二氧化碳的排放使得温室效应日趋严重。开发可持续发展的绿色新能源为这一系列的问题提供了解决之道，并引起了广泛关注。其中以富油生物质为原料，提取脂肪酸甲酯混合物，即生物柴油为能源的开发提供了广阔的前景。尤其是微藻，因为具有不占用耕地，生长快速，容易培养，含有量高，品种丰富等特点，在生物柴油领域受到了越来越多的关注。国际专利技术专利公开号W02008/151373公开了一种优质供应藻类养殖及生物柴油的方法和装置。中国专利公开号CN 101368193A公开了一种微藻培养联合生物柴油制备的生产方法，获得了热值高达42MJ· Kg—1生物柴油。中国专利公开号CN 101649332A公开了一种以藻类为原料，通过萃取，酯交换，静置分层及蒸馏手段获得生物柴油的方法。但是，以上专利对藻类在不同装置不同培养条件下产油能力的评价不清晰，也不一致，难以进行横向比较。十六烷值作为表征生物柴油自燃性的指标，是国际上公认的生物柴油质量的重要评估指标，但是十六烷值的检测实际操作复杂，且相关设备造价昂贵，普及性不强。 Krisnangkura K在1986年提出柴油的十六烷值与皂化值及碘值有线性相关性，并给出相关公式(KrisnangkuraK. 1986. A simple method for estimation of cetane index of vegetable oil methyl esters. Journal ofthe American Oil Chemists' Society 63(4) :552-553.)。而且大量研究表明生物柴油的十六烷值，皂化值及碘值与其中各个不同脂肪酸甲酯的含量及组成密切相关(Azam MM, Waris A，NaharNM. 2005. Prospects and potential of fatty acid methyl esters of some non-traditional seed oils foruse as biodiesel in India. Biomass & Bioenergy 29(4) :293_302·)，并建立了相应的经验公式。本专利技术将其引入评定指标中，从而可以轻易实现不同培养条件下不同藻种的产油能力的比较，从而为最优藻种的选择和培养方法的优化提供依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术的技术方案概述如下，包括如下步骤(1)细胞收集及淬灭取出已培养好的藻液样品3-5份，每份100-150mL，4°C下3000-5000rpm，离心 3-4min,收集下层的细胞，用3_5mL代谢终止液在-40°C下淬灭5_10分钟，终止代谢反应， 在-80°C下冷冻干燥4-6h获得冻干细胞；所述代谢终止液为含有1500mg · L4NaNO3Jemg · I^1CaCl2 · 2H20， 75mg · L-1MgSO4 · 7H20和40mg · L^K2HPO4 · 3H20的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1 2;(2)提取细胞内脂肪酸取步骤(1)获得的冻干细胞15-25mg分别置于离心管中，每管加入0. 75-1. 5mL氯仿及0. 3-0. 6mL超纯水，IOOrpm震荡Ih ；再加入2_4mL脂肪提取液，室温下以IOOrpm震荡 0. 5h，收集氯仿相；向残渣中加入2-4mL脂肪提取液，室温下以IOOrpm震荡0. 5h，收集氯仿相；反复提取3次，将氯仿相合并，再加入0. 5-lmL IM KCl水溶液，震荡，3000-4000rpm， 离心3-5min,弃水相，再加入l_2mL超纯水，震荡，3000-4000rpm，离心3_5min，弃水相， 30-35 °C真空干燥得干物质；所述脂肪提取液为体积百分含量为66. 7%的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液含有质量百分比为0. 的二丁基羟基甲苯；(3)脂肪酸甲酯化将所述干物质溶于600-1000 μ L质量百分比为14%的三氟化硼-甲醇溶液中， 加入IOIOyg十七烷酸做为内标，置于15mL密封管内，在100°C水浴20-30min，温度降至室温，加入500-1000 μ 1正己烷震荡萃取30s，4000-5000rpm离心2min，得到正己烷相；取 100-200 μ L正己烷相放入已编号的GC进样瓶；(4) GC-MS 检测采用GC-MS对正己烷相中的脂肪酸甲酯进行定性和定量处理，条件如下色谱柱DB-5气相色谱柱，其规格为30m*0. 25mm, 0. 25 μ m ；进样量lyL;分流比10 1 ；进样口温度280°C;GC interface 温度270°C ；氦气流速恒压，9 IKPa ；升温程序70°C保持2min，以8°C -min"1的速度升到290°C，并在290°C保持6min ；电离电压70eV;源温250°C；扫描范围50-800m/z；扫描速度:2scan· ；从而获得了脂肪酸甲酯混合物中的单个脂肪酸甲酯的含量；(5)计算日产量根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的日产量P=E ffi/Day/CV其中P是微藻脂肪酸甲酯日产量，Wi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的重量，Day是步骤(1)所述从微藻接种到微藻收获的时间长度，CV是步骤(1)所述收获时微藻培养液的体积；(6)十六烷值确定根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的十六烷值SN=E (560 X Pi)/MWiaIN Σ (254XDXPi)/MWibCN = 46. 3+5458/SN-O. 225 XIN c其中SN是皂化值；IN是碘值；CN是十六烷值；Pi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的干重百分比，MWi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的分子量，D是步骤 (4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的双键数量。所述的微藻涉及但不限于小球藻(Chlorella sorokiniana)、栅藻(Scenedesmus obliquus)、集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)及鱼腥藻(Anabaena sp. PCC7120)。本专利技术提供了，这种方法能为比较不同培养体系下不同藻种产油能力提供标准，从而为最优的藻种选择和培养工艺优化提供依据。附图说明图1为小球藻不同接种密度培养下0D560达到1. 5时的脂肪酸甲酯日产量变化；图2为小球藻不同接种密度培养下0D560达到1. 5时的脂肪酸甲酯十六烷值变化。具体实施例方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明实施例1，包括如下步骤(1)小球藻(Chlorella sorokiniana)细胞收集及淬灭对小球藻(Chlorella sorokiniana)进行不同接种密度的培养，初始接种密度分别设置为IX 104，IX 105，IX IO6及IXlO7ceIls ·πι Λ在细胞培养至0D560为1. 5，每个接种密度的微藻分别取出5份藻液样品，每份本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，陆姝欢，杨洁，牛艳红，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：
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