蛋白质制造技术

本发明专利技术涉及制备变体脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表达核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90％的同一性并且在对应于所编码氨基酸序列中的位置包含至少一个以下修饰：a)与原真菌脂肪分解酶相比在所述氨基酸序列中引入至少一个糖基化位点(或一个额外的糖基化位点)；b)在所述多肽的表面位置和所述酶活性位点(催化三联体)的远侧外环内的位置引入至少一个氨基酸，所述氨基酸更加亲水(与原氨基酸相比)；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一个或多个位置的取代或插入，或者在311-312或307-319位中的一个或多个位置的删除，其中各氨基酸位置均对应于与SEQ?ID?No.2比对时所述氨基酸序列的位置；其中当所述核苷酸序列与编码SEQ?ID?No.22或SEQ?ID?No.23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列具有至少90％的同一性时，所述修饰不是在63位的取代并且所述删除不在311-312位。优选地，所述核苷酸序列与SEQ?ID?No.1具有至少90％同一性。本发明专利技术还涉及通过所述方法产生的多肽以及新核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新的(变体)脂肪分解酶和一个或多个编码一个或多个新脂肪分解酶的多核苷酸。本专利技术还涉及产生脂肪分解酶的方法及其应用。本专利技术还涉及改良食品的制备，尤其是改良烘焙产品的制备。具体地，本专利技术涉及脂肪分解酶，所述酶能够赋予包括烘焙产品在内的食品产品改良的特征。
技术介绍
在食品和/或饲料工业中使用的脂肪分解酶(E.C.3.1.1.x)的有益用途已知多年。例如，在EP 0 585 988中主张向生面团中加入脂酶可改善保鲜效果，并且提出获自少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)的脂酶在与起酥油/脂肪(shortening/fat)联用时，添加至生面团时能够改善所得面包的质量。WO94/04035中教导可通过在生面团中添加脂酶但向所述生面团添加任何脂肪或油即获得改善的面包柔软性。Castello，P.ESEGP 89-10 Dec.1999 Helsinki表明外源性脂酶可以改变面包体积。小麦粉中脂酶作用的底物是1.5-3％内源性小麦脂质，所述内源性小麦脂质是极性与非极性脂质的复杂混合物。极性脂质可分为糖脂和磷脂。这些脂质由两个脂肪酸所酯化的甘油和极性基团构成。所述极性基团促成这些脂质的表面活性。对这些脂质中的脂肪酸之一的酶切导致表面活性高出很多的脂质。已知诸如DATEM的具有高表面活性的乳化剂在添加到生面团中时产生显著作用。脂肪分解酶可从存在于食品中的脂质水解一种或多种脂肪酸，这可以在食品中产生有效的乳化剂分子，从而提供具有商业价值的功能性。提供最显著的乳化特性的分子是部分水解产物，诸如溶血磷脂(lyso-phospholipid)、溶血糖脂(lyso-glycolipid)和甘油单酯(mono-glyceride)分子。极性脂质水解产物，即溶血磷脂和溶血糖脂尤其有利。在制作面包时，这种原位产生的乳化剂可 起到与乳化剂(例如DATEM)等价的作用。但是，也发现脂肪分解酶的活性导致游离脂肪酸的蓄积，这会在食品中产生不良作用。脂肪分解酶的这一固有活性限制了其功能。对面包体积的负面影响往往以剂量过大(overdosing)来解释。剂量过大可导致面筋弹力下降，这使生面团过硬，并因此使面包体积缩小。另外，或可选地，这些脂酶能降解添加到生面团中的起酥油、油脂和乳脂，导致生面团和烘焙产品有不良风味。剂量过大和不良风味归因于面团中游离脂肪酸(尤其是短链脂肪酸)的蓄积。原料或食品产品中高水平游离脂肪酸(FFA)的存在普遍被认为是质量缺陷，食品生产商和消费者往往在食品规范中规定了FFA的最高水平。过量FFA水平所产生的作用会导致感官和/或功能上的缺陷。在WO2005/087918中鉴定了来自镰刀菌(Fusarium)物种，例如异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)CBS 782.83的新型真菌脂肪分解酶，并且发现其在某些应用中其具有优越的性质。这些酶在汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)中表达并且显示主要水解出生面团中糖脂和磷脂sn-1位置的脂肪酸。一些真菌脂肪分解酶的问题是所述酶的表达可能受限并因此可能具有高生产成本。例如，适合工业规模活性的大量酶表达可能受到限制。工业上感兴趣于发现表达增强的新脂肪分解酶，特别是这能够在没有功能性和/或活性受损的情况下实现时。专利技术概述已经意外地发现，与制备出本专利技术新变体脂肪分解酶的野生型酶相比，本专利技术新变体脂肪分解酶显示了提高的表达。值得注意的是，所述提高的表达是在不损害酶功能性和/或活性和/或应用性的情况下实现的。此外，与野生型酶相比，新的变体脂肪分解酶还可以显示改善的功能性和/或活性。本专利技术人已经发现，通过改变(取代或插入)位于脂肪分解酶活性位点(催化三联体)的远侧外环中的一个或多个表面氨基酸，以用(与原氨基酸相比)更亲水的氨基酸代替所述表面氨基酸，或者引入亲水氨基酸，或者引入糖基化位点，随后，与野生型酶相比，可显著且惊人地提高所述变体酶的表达和/ 或功能性和/或活性。优选地，为了引入一个或多个糖基化位点，用Asn、Ser和/或Thr(或其组合)代替所述表面氨基酸。可选地，或者此外，可以通过插入选自Asn、Ser和/或Thr的一个或多个氨基酸修饰活性位点远侧的外环，以引入一个或多个糖基化位点。脂肪分解酶通常在脂肪和水之间(即亲水环境和疏水环境之间)的界面起作用，因此，脂肪分解酶在某些应用中的性能非常依赖于该界面以及水活性。不希望受理论约束，通过在远离酶活性位点的位置(即酶活性位点远侧的环中)改变脂肪分解酶表面的亲水性，可控制酶在脂肪/水界面内的朝向，从而使所述活性位点朝向酶的底物，即脂肪。因此，可修饰脂肪分解酶以优化酶在界面内的朝向，从而提高酶活性。此外，或者可选择地，通过引入糖基化位点可增强酶的折叠以及从宿主生物的表达和/或分泌，由此增强变体酶的表达。此外或者可选地，本专利技术人还发现了惊人地显著提高脂肪分解酶的表达和/或功能和/或活性的多种特异修饰。这些可包括加入糖基化位点和/或稳定酶的C-末端区域。在一些实施方式中，特异的修饰提高了表达，但不损害脂肪分解酶的功能性和/或活性。因此，与野生型(KLM1)酶相比，一些所述特异修饰提高了表达，而不损害变体酶的应用性能，所述野生型(KLM1)酶的前原序列(propresequence)在本文中示为SEQ ID No.2(其成熟形式为SEQ ID No.2的氨基酸31-305)。因此，一方面，本专利技术提供了制备变体脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表达核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90％的同一性，或者通过一个或数个核酸的添加、删除或取代而不同于编码真菌脂肪分解酶的核苷酸序列，并且在对应于所编码的氨基酸序列中的位置包含至少一个以下修饰：a)与原真菌脂肪分解酶相比，在所述氨基酸序列中引入至少一个糖基化位点(或一个额外的糖基化位点)；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位点(催化三联体)的远侧外环内的位置引入至少一个氨基酸，所述氨基酸更加亲水(与原氨基酸相比)；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一个或多个位置的取代或插入或者在311-312或307-319位中的一个或多个位置的删除，其中各氨基酸位置均对应于与SEQ ID No.2比对时所述氨基酸序列的位置；其中当所述核苷酸序列与编码SEQ ID No.22或SEQ ID No.23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列具 有至少90％的同一性或者通过一个或数个核酸的添加、删除或取代而不同于编码SEQ ID No.22或SEQ ID No.23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列时，所述修饰不是在63位的取代并且所述删除不在311-312位(其中比对时所述氨基酸位置编号为SEQ ID No.2所示)。所述方法可以通过在多肽的表面位置取代或插入一个或多个氨基酸而在所述表面位置引入至少一个氨基酸，其中所述取代或插入时用(与原氨基酸相比)更亲水的氨基酸。在另一个实施方式中，本专利技术提供了产生变体脂肪分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.06.25 US 61/220,2881.制备变体脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表达核苷酸序列，
所述核苷酸序列与编码真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90％的同一性
并且在对应于所编码氨基酸序列中的位置包含至少一个以下修饰：a)与原真
菌脂肪分解酶相比在所述氨基酸序列中引入至少一个糖基化位点(或一个额
外的糖基化位点)；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位点(催化三联
体)的远侧外环内的位置引入至少一个氨基酸，所述氨基酸更亲水(与原氨基
酸相比)；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一个或多个位
置的取代或插入，或者在311-312或307-319位中的一个或多个位置的删除，
其中各氨基酸位置均对应于当与SEQ ID No.2比对时所述氨基酸序列的位
置；其中当所述核苷酸序列与编码SEQ ID No.22或SEQ ID No.23所示的真
菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列具有至少90％的同一性时，所述修饰不是在
63位的取代并且所述删除不在311-312位。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述真菌脂肪分解酶在修饰前不
包含任何糖基化位点。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述核苷酸序列与SEQ ID No.
1，与SEQ ID No.24，或与SEQ ID No.24的23-106位所示的核苷酸序列，
或与SEQ ID No.24的113-1063位所示的核苷酸序列，或与SEQ ID No.24
的113-929位所示的核苷酸序列具有至少90％同一性。
4.产生脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表达包含SEQ ID No.
8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID 
No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26的
核苷酸序列；或者与其具有至少98％同一性的核苷酸序列；或者通过遗传密
码的简并性与SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.
10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ 
ID No.20或SEQ ID No.26的核苷酸序列相关的核酸。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述修饰对应于在所
述多肽的表面位置和在所述酶活性位点的远侧外环内的位置引入至少一个糖
基化位点。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修
饰，从而在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位点的远侧外环内的位置的
一个或多个氨基酸被比原氨基酸更亲水的氨基酸取代。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修饰，
从而使一个或多个亲水性氨基酸被插入在所述多肽的表面位置和在所述酶活
性位点的远侧外环内的位置。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修饰，
从而在所编码的氨基酸中取代或插入一个或多个氨基酸以产生一个或多个共
有序列Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中Xxx可为除Pro外的任何氨基酸。
9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修饰，
从而在所编码的氨基酸序列中引入一个或多个Asn、Ser或Thr。
10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，引入至少2个、优选
至少3个糖基化位点。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述核苷酸序列被进
一步修饰以与SEQ ID No.2相比增强了所述蛋白的C-末端加工。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述C-末端为从306位氨基酸向
前，其中所述位置对应于比对时SEQ ID No.2的氨基酸序列中的位置。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述C-末端加工包括以下
一个或多个：在306位或320位的取代或插入或者在所述C-末端的一个或多
个KEX2位的删除，其中各位置均对应于SEQ ID No.2的氨基酸序列的位置。
14.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述C-末端加工包
括以下一个或多个：在306位或320位的取代，或者在311-312或307-319
位中的一个或多个位置的删除，其中各位置均对应于SEQ ID No.2的氨基酸
序列的位置。
15.根据前述任一项权利要求所述的方法，所述核苷酸序列被修饰，从
而在33、63、78、190和305位中的一个或多个位置具有取代，其中所述氨
基酸被N取代。
16.根据前述任一项权利要求所述的方法，所述核苷酸序列被修饰，从
而在306位具有取代，其中所述氨基酸被除K或R或A以外的任意氨基酸
取代，优选所述306位的取代是被氨基酸S取代。
17.根据前述任一项权利要求所述的方法，所述核苷酸序列被修饰，从
而在320位具有取代，其中所述氨基酸被除T以外的任意氨基酸取代，优选
所述320位的取代是被氨基酸E取代。
18.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述宿主生物为真菌，
优选来自木霉属(Trichoderma)，更优选来自里氏木霉(Trichoderma reesei)种。
19.通过前述任一项权利要求所述的方法获得的多肽(前原多肽或脂肪
分解酶)。
20.包含核苷酸序列的核酸，其中，所述核苷酸序列编码脂肪分解酶并
且在对应于所编码的氨基酸序列中的位置包含至少一个以下修饰：a)在所述
氨基酸序列中引入至少一个糖基化位点；b)在所述多肽的表面位置和在所述
酶活性位点(催化三联体)的远侧外环内的位置引入至少一个亲水氨基酸；或
c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一个或多个位置的取代或插
入，或者在311-312或307-319位中的一个或多个位置的删除，其中各氨基
酸位置均对应于SEQ ID No.2的氨基酸序列的位置；其中当所述核苷酸序列
编码SEQ ID No.22或SEQ ID No.23所示的真菌脂肪分解酶时，所述修饰不
是在63位的取代并且所述删除不在311-312位。
21.根据权利要求20所述的核酸，其中，所述真菌脂肪分解酶在修饰前
不包含任何糖基化位点。
22.根据权利要求20或21所述的核酸，其中，所述核苷酸序列与SEQ ID 
No.1，与SEQ ID No.24，或与SEQ ID No.24的23-106位所示的核苷酸序
列，或与SEQ ID No.24的113-1063位所示的核苷酸序列，或与SEQ ID No.
24的113-929位所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的核酸，其中，所述核苷酸序列
包含至少一个修饰，所述修饰对应于用比原氨基酸更亲水的氨基酸取代位于
所述多肽的表面位置和所述酶活性位点的远侧外环中的位置的一个或多个氨
基酸。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的核酸，其中，所述核苷酸序列
包含至少一个修饰，所述修饰对应于在所述多肽的表面位置和所述酶活性位
点的远侧外环中的位置插入一个或多个更亲水的氨基酸。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的核酸，其中，所述核苷酸序列
包含至少一个修饰，所述修饰对应于一个或多个氨基酸的取代或插入以提供
一个或多个共有序列Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中Xxx可以是所编码
的蛋白中除Pro外的任何氨基酸。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的核酸，其中，所述核苷酸序列
包含修饰，所述修饰对应于在所编码的蛋白中引入一个或多个Asn、Ser或
Thr。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的核酸，其包含编码至少两个，
优选至少三个糖基化位点的密码子。
28.根据权利要求20-27中任一项所述的核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德雷·米亚斯尼科夫，理查德·R·博特，延斯·弗里斯贝克·瑟伦森，
申请(专利权)人：丹尼斯科公司，
类型：发明
国别省市：